三疣梭子蟹心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证

采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp, 5￠端非编码区72bp,3￠端非编码区108bp,开放阅读框426bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6kD,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和蓝蟹(Callinectes sapidus)的CCAP同源性较高,分别为85%和82%。系统进化树分析显示,三疣梭子蟹与蓝蟹首先聚为一支,之后再与拟穴青蟹相聚。组织表达分析发现, CCAP基因在胸神经节中的相对表达量最高,其次是脑和眼柄组织。通过分析CCAP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐可显著改变CCAP在胸神经节中的表达模式,在24 h, 48 h和72 h实验组的表达量显著高于对照组(P0.05),分别为对照组的1.73, 2.16和2.19倍。体外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低盐条件下的死亡率,并诱发钠钾ATP酶(Na~+/K~+-ATPase)和V型ATP酶(V-ATPase)酶活力显著提高。本实验结果暗示CCAP通过调控Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力以达到盐度适应的作用。     

拟穴青蟹14-3-3基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆获得14-3-3基因cDNA全序列.序列分析结果表明:拟穴青蟹14-3-3基因全长1112bp,开放阅读框长744 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为28.086 ku,等电点为4.675.与其他物种14-3-3基因氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹14-3-3基因与斑节对虾14-3-3基因同源性最高(95％),依次为墨吉对虾(93％)、苜蓿切叶蜂(92％).聚类分析表明,拟穴青蟹14-3-3基因氨基酸序列与斑节对虾、墨吉对虾紧密聚为一支.经荧光定量检测,拟穴青蟹14-3-3基因在肝胰腺和肌肉中的表达量较高,其次为鳃、眼柄、心脏和肠,在胃中表达最少.盐度骤变实验结果表明:盐度胁迫24 h后,盐度的下降(5)或者上升(15、20、25、30)都引起了14-3-3基因在鳃中的表达量极显著上升(P＜0.01),盐度变化的幅度越大,14-3-3基因的表达量越多.实验结果为进一步深入研究14-3-3基因的功能及调控机理奠定基础.     

拟穴青蟹一种含CTLD结构域基因的克隆及表达分析

从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆得到一个含有CTLD(C-type lectin-like domain)结构域的C型凝集素基因,经分析未发现同源基因,将其命名为SpCTLD。该基因cDNA序列全长为1 237 bp,包含一个468 bp的开放阅读框,编码155个氨基酸,预测分子量为18.32 kDa,等电点为7.56。经一代测序,该基因在第390位(A390G)和第1 020位(T1020C)含有两个SNP位点。对SpCTLD基因在拟穴青蟹幼体不同时期和组织中的表达模式分析发现,SpCTLD在幼体的各个发育时期均有表达,其中在溞状幼体Ⅴ期表达量最高,仔蟹Ⅰ期次之,仔蟹Ⅱ期最低。对SpCTLD的组织分布分析表明,SpCTLD在鳃中表达量最高,其次为射精管,在血淋巴、肝胰腺等其他免疫组织中也有表达,其中在鳃和射精管的表达量远高于在其他组织中的表达量。副溶血弧菌胁迫实验表明,活菌组的肝胰腺、血淋巴、鳃中的SpCTLD表达量发生显著上调,且都在12 h达到最高。根据研究结果,推测SpCTLD是一种含CTLD结构域的新基因,它可能参与了拟穴青蟹抗细菌反应。该基因的发现丰富了拟穴青蟹C型凝集素相关基因的研究,有利于丰富甲壳动物先天免疫机制的研究。     

中国明对虾NHE3基因克隆及其在pH胁迫下的表达

为研究钠/氢交换体(Na+/H+-exchanger,NHE)在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)响应pH胁迫过程中发挥的作用,首先采用静水毒性实验方法确定了中国明对虾酸碱半致死pH,然后利用RACE技术克隆了中国明对虾Na+/H+-exchanger isoform 3(命名为FcNHE3)基因,并通过荧光定量PCR及RNA干扰技术分析了其在pH胁迫下的表达特征及功能。结果显示,72 h酸性半致死pH和碱性半致死pH分别为5.2和9.1。克隆获得FcNHE3基因(Gen Bank:MF373587)cDNA序列全长3508 bp,开放阅读框2805 bp,编码934个氨基酸,具有信号肽和12个跨膜结构域;蛋白同源分析发现,FcNHE3与青蟹(Carcinus maenas)同源性最高,达到74%;系统进化分析显示,FcNHE3与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和青蟹亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,FcNHE3基因在鳃组织中表达量显著高于其他组织(P0.05);酸性半致死pH(pH 5.2)胁迫下,FcNHE3基因在整个胁迫过程中显著上调表达(P0.05);碱性半致死pH(pH 9.1)胁迫下,FcNHE3基因在前48 h显著下调表达(P0.05),12 h表达量最低,仅在72 h出现上调表达。RNA干扰后,FcNHE3基因表达受到抑制,pH 5.2胁迫下对虾存活率相比对照组显著下降。研究表明相较于高pH胁迫,FcNHE3基因在中国明对虾响应低pH胁迫过程中可能发挥更重要的调节作用。     

低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达

本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)蝗抗利尿肽(neuroparsin,PtNP)基因。该基因全长1920 bp,5￠端非编码区237 bp,3￠端非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 k D,理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基,具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明,PtNP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现,PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高,其次是鳃和眼柄,在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。通过分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达模式,整体呈现上调表达趋势,其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调至7.7倍、2.8倍和2.6倍,且存在显著差异(P0.05)。去除眼柄后该基因在鳃中的表达呈上升趋势,且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组(P0.05)。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。     

拟穴青蟹GRP78基因的克隆与应激表达

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ku,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一,在调节蛋白质折叠和维持内质网稳态过程中起着分子伴 侣作用。采用RT-PCR、RACE等技术,首次从拟穴青蟹获得了GRP78的cDNA全长序列。该序列全长2 284 bp,开放阅读框(ORF)为1 962 bp,编码653个氨基酸残基。 同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,与其他物种具有很高相似性。实时荧光定量PCR结果表明,GRP78 基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达。第一期仔蟹在不同的温度和盐度下暴露12 h后,GRP78基因表达量随环境温度升高而增加;在高盐(30)条件下GRP78表达量 较高,进而推测拟穴青蟹GRP78参与蛋白质折叠和环境胁迫的应答。     

饥饿胁迫对拟穴青蟹大眼幼体的比较转录组分析

为了探究甲壳类幼体应对饥饿胁迫的分子机理，以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为研究对象，设置正常投喂组和饥饿组，处理3 d后对不同组别的拟穴青蟹大眼幼体进行转录组测序并开展生物信息学分析。De novo组装后共获得79 581个unigene,平均长度1 065.44 bp。Nr数据库共注释20 061个unigene。DESeq分析筛选出5 621个差异表达基因，饥饿组相比对照组2 641个上调、2 980个下调。基因本体论(GO)富集分析表明，共254条GO Term显著富集(矫正后的P值小于0.05)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析表明，共60条KEGG pathway显著富集(矫正后的P值小于0.05)。基于KEGG富集分析结果筛选了一系列与饥饿胁迫相关的代谢通路，如DNA复制、细胞凋亡、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸代谢、亚油酸代谢、淀粉和蔗糖代谢。研究表明，饥饿胁迫干扰了拟穴青蟹大眼幼体的细胞分裂和凋亡，影响了体内的氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢。研究结果可为拟穴青蟹苗种的健康培育提供理论参考，并丰富拟穴青蟹的分子生物学基础数据。     

盐度突降对拟穴青蟹大眼幼体生长发育和Na~+/-K~+-ATPase活性的影响

研究了盐度突降对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)大眼幼体生长发育和Na+/-K+-ATPase活性的影响。实验用水由海水和淡水配制成20%、40%、60%、80%和100%SW,其盐度分别为6.4、12.8、19.2、25.6和32.0。在不同环境盐度突降条件下,盐度6.4处理组拟穴青蟹大眼幼体在24 h内全部死亡;盐度12.8、19.2、25.6和32.0处理组拟穴青蟹大眼幼体的存活率无显著差异(P≥0.05),各处理组幼体蜕皮持续时间分别为2、2、3和4 d;当发育至C1期第2天时,盐度12.8处理组体重平均增量低于盐度19.2、25.6和32.0处理组,且差异显著(P<0.05)。盐度6.4处理组酶活性从实验开始即急速增加,至6 h时与其它各组呈显著差异(P<0.05);盐度32.0处理组酶活性从实验开始就下降,至72 h后变化趋于平缓;盐度12.8、19.2和25.6处理组酶活性在6 h内逐渐上升,之后迅速下降,于72 h时降至最低,之后酶活性变化趋于平缓。在96~120 h内,盐度12.8处理组酶活性始终显著高于25.6和32.0处理组(P<0.05)。结果表明,拟穴青蟹大眼幼体生长的最适盐度为19.2,适宜生长盐度下限在12.8~19.2之间,生存盐度下限在6.4~12.8之间。     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因的克隆与表达分析

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。