病原诱导水产动物细胞凋亡途径研究进展

凋亡是机体为维持内环境稳定而由基因控制的细胞的自主、有序性死亡,与细胞坏死的方式不同。近年来的一些研究显示,水产病原致病过程中可诱导宿主细胞凋亡。文章总结并展望了细菌、病毒和寄生虫诱导水产动物细胞凋亡的研究进展和发展趋势,可为水产病原致病机制的深入研究提供参考。     

喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的研究

细胞凋亡(apoptosis)是受基因控制的细胞自主的有序死亡。凋亡细胞的形态特征主要表现为细胞核的染色质浓缩,边移,聚集在核膜下,进而核发生裂解,核碎片与细胞碎片有单层膜包裹形成凋亡小体(apoptosisbody)[1]。目前已发现某些物理因素(辐射、高温等)、细胞因子、病毒感染和     

哺乳动物黄体溶解的调控

黄体溶解的机理目前仍不十分清楚，已证实细胞凋亡在黄体溶解中起重要作用。激素和包括细胞因子在内的一些卵巢局部因子通过内分泌、自分泌和／或旁分泌方式参与了黄体细胞凋亡的调控，一些调节基因也参与了此过程一在生理情况下，它们之间可能存在着“激素－卵巢局部因子－基因”这样一个相互影响的级联调控机制，影响着黄体机能＿     

镉胁迫诱导胭脂鱼血细胞凋亡的研究

以胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)离体血细胞为实验材料,用不同浓度的氯化镉溶液处理.通过瑞士姬姆萨和AO/EB荧光染色,在光学和荧光显微镜下观察了血细胞的形态变化,并统计了细胞的凋亡率.结果显示,在氯化镉的胁迫作用下,胭脂鱼血细胞呈现细胞变圆、核变圆、核边缘化、形成凋亡小体等细胞凋亡的形态特征.较低Cd2+浓度(0.01 mmoL/L)胁迫,1 h即可产生明显的细胞凋亡诱导效应,并且细胞凋亡率随着Cd2+浓度的增加和作用时间的延长而升高.表明Cd2+能诱导胭脂鱼血细胞发生典型的凋亡,而且细胞凋亡率与Cd2+浓度和处理时间成明显的剂量-效应关系.     

扇贝多肽对氧化所致胸腺细胞凋亡的影响

观察扇贝多肽(Polypeptide from Chlamys ferreri)(PCF)对实验性氧化所致小鼠胸腺细胞凋亡的影响。采用台盼蓝(Trypan Blue)活细胞拒染法在普通光学显微镜下观察细胞的存活率；以四甲基氮唑盐(MTT)法测定细胞的增殖活性；以生化检测(DNA ladder)法观察PCF对细胞DNA片断化的影响；用透射电镜观察细胞的超微形态结构变化。台盼蓝染色法证实PCF能增强细胞的活性并与PCF浓度成正比；MTT法表明PCF不仅能保护细胞免受损伤，而且还能促进细胞的增殖，并有PCF依赖性；生化检测显示PCF能减少细胞凋亡的DNA片断化数目；细胞的超微结构还表明PCF能维持细胞结构的完整性。PCF可明显抑制实验性氧化损伤小鼠胸腺细胞的凋亡并有药物依赖性，而且明显优于维生素C。     

低温胁迫对暗纹东方鲀肠道氧化应激、细胞凋亡及肠道微生物组成的影响

为了探究低温胁迫对暗纹东方鲀肠道氧化应激、细胞凋亡及肠道微生物组成的影响，实验测定了3个处理温度 (25、19和13 °C)，4个取样时间点 (0、6、24和96 h)下氧化应激、细胞凋亡与肠道微生物相关指标。结果显示，与对照组相比，随着温度降低肠道绒毛发生坏死、增生和杯细胞肿大。总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)的活性以及丙二醛 (MDA)含量显著增加。肠道微生物组成多样性降低。肠道微生物丰度发生改变，如黄色杆菌属、副球菌属、乳球菌属和双歧杆菌属的丰度随温度降低而上升，梭菌属、气单胞菌属和嗜热芽孢杆菌属的丰度随温度上升而下降。细胞凋亡相关基因 (caspase-3、caspase-7、caspase-9、p53、Bax和Bcl-2)的表达随温度降低升高。此外，实验发现副球菌属和嗜热芽孢杆菌属丰度的改变与肠道氧化应激、细胞凋亡均具有Pearson相关性，其可作为潜在微生物用来反映暗纹东方鲀是否处于氧化应激和细胞凋亡状态。本研究结果可为暗纹东方鲀健康养殖提供基础资料。     

睾丸生精细胞凋亡的影响因素

关于生精细胞的凋亡受很多因素的影响,与激素、药物、环境以及动物本身的发育阶段等因素有关。本文对影响睾丸生精细胞凋亡的因素作一综述。     

DAD1和AIF-1细胞因子在鱼类中的研究进展

细胞因子是一类由多种细胞合成或分泌的可溶性蛋白与多肽物质,具有调节多种细胞生理功能的作用.抗细胞凋亡因子(DAD1)是一种内源性细胞凋亡抑制基因.同种移植炎症因子(AIF-1)是一种由干扰素r诱导的钙离子结合蛋白.本文概述了DAD1和AIF-1的结构特点、功能表达、生物学作用及在水产动物中的最新研究进展,旨在为水产动物细胞因子的研究和有效应用提供参考资料.     

细胞凋亡的分子机理及其检测方法研究进展

细胞凋亡(apoptosis)是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后一种主动的、由一些凋亡相关基因相互作用的细胞消亡过程.凋亡的发生具有积极的生物学意义,是维持机体内环境稳定所必需.细胞凋亡与有丝分裂相互协调,共同控制胚胎发育、器官的发育与退化以及免疫、造血等生理过程.     

芦丁对吉富罗非鱼幼鱼组织切片及细胞凋亡的影响

在快速生长期日粮中添加较高浓度芦丁(0、0.1和0.3 g/kg),通过免疫、生殖器官组织切片和Tunel细胞凋亡分析,探究芦丁作为饲料免疫增强剂对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼组织切片及细胞凋亡的影响。结果表明低浓度芦丁会使肠道血小板增多,杯状细胞不规则;肝脏kupffer细胞少;并会造成肠道和肝脏细胞凋亡阳性率增高。高浓度芦丁组肝、脾脏出现细胞凋亡和含铁血黄素沉着;且造成肝脏和脾脏细胞凋亡阳性率增高;脾脏黑色素巨噬细胞中心少。此外,高浓度芦丁会对精巢、卵巢的发育起到抑制作用。芦丁作为水产行业免疫增强剂需慎用。     

dusp1敲降对低温诱导斑马鱼ZF4细胞凋亡的作用

为了研究双特异性磷酸酶(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因与鱼类低温诱导的细胞凋亡之间的关系,本研究经Eco RI和Age1酶切构建plko.1-dusp1-sh RNA1,plko.1-dusp1-shRNA2,plko.1-negative control(nc),plko.1-EGFP的重组质粒,并分别与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.9.1、pCMV-VSVG共同转染至293T细胞中,经293T细胞包装的病毒,感染斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维样细胞(zebrafish embryos fibroblast like cell line,ZF4),RT-PCR检测表明dusp1成功被敲降。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,将细胞于28℃培养(正常对照组)或经10℃低温处理10 d,使用annexin V-FITC/Propidium lodide(PI)双色标记流式细胞术检测ZF4细胞凋亡情况。结果显示:低温胁迫下dusp1敲降的细胞凋亡(dusp1-shRNA1敲降,dusp1-kd1;dusp1-shRNA2敲降,dusp1-kd2)比例较nc组显著上调,其中早期凋亡和晚期凋亡细胞比例dusp1-kd1显著高于nc组,并且dusp1-kd1活细胞数显著低于nc组(P0.05),进一步证明dusp1参与鱼类冷应激过程,并在低温情况下保护细胞。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定了基础,其中dusp1基因沉默型斑马鱼细胞在10℃低温处理10 d凋亡数显著大于对照组,证明dusp1在细胞凋亡信号通路中起到重要调控作用,为低温下研究斑马鱼基因的分子机制提供新的思路。     

用流式细胞术检测喹乙醇诱导的鲤肝细胞凋亡

采用含200 mg.kg-1喹乙醇的饲料连续饲喂鲤鱼(Cyprinus carpioLinnaeus),分别于饲喂后的第7天、14天、20天、25天和第30天各剖杀4尾鱼,取肝组织,用流式细胞仪检测其细胞凋亡程度。结果显示,在肝细胞DNA直方图中,于G1峰之前出现一AP峰,且AP峰峰值随染毒时间的延长而升高,肝细胞在不同时期的凋亡率与染毒时间呈正相关。在经喹乙醇染毒第7天,鲤肝细胞的凋亡率平均值为2.05%,而对照组为1.70%,两组间差异不显著(P>0.05);在第14天,可见轻微的AP峰;在第20天,凋亡率达到9.49%,凋亡峰已较明显;在第25天时的AP峰比第14天时峰值明显升高;在染毒第30天时,凋亡率达17.44%,AP峰明显可见,其肝细胞凋亡率与第7天、第14天和第25天时差异显著。在整个过程中,对照组的正常G1峰前几乎看不出有AP峰存在。在实验组内,不同染毒时间,实验各组的肝细胞凋亡率差异显著,对照组内差异不显著。     

黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导鲫细胞凋亡的影响

为研究黄芪多糖(APS)和当归多糖(ASP)对维氏气单胞菌诱导鲫细胞凋亡的影响,实验设阴性对照组、阳性对照组,黄芪多糖组和当归多糖组,通过对鲫用维氏气单胞菌攻毒处理,用流式细胞仪测定血细胞的凋亡比例和细胞周期变化,并用荧光显微镜和透射电镜观察凋亡细胞的形态。结果显示,维氏气单胞菌攻毒后阳性对照组鲫血细胞的细胞凋亡率均极显著高于多糖组和阴性对照组;多糖组能显著降低鲫的细胞凋亡率且黄芪多糖组效果更显著;攻毒后鲫肝细胞和肾脏淋巴细胞出现染色质凝集、细胞核固缩边集和细胞空泡化及凋亡小体;同阴性对照组相比;维氏气单胞菌攻毒可以引起鲫血细胞周期中S/G2+M期细胞比例极显著下降,sub-G1极显著升高,抑制细胞分裂诱发凋亡;多糖组则G0/G1期细胞极显著降低,S/G2+M期细胞极显著升高,sub-G1极显著降低,促进细胞分裂抑制凋亡。黄芪多糖和当归多糖添加量在1%时能抑制维氏气单胞菌攻毒引起的细胞凋亡。     

鱼诺卡氏菌动力蛋白调节蛋白robl/LC7的亚细胞定位和功能初步研究

鱼类诺卡氏菌病是一种慢性系统性肉芽肿疾病,鱼诺卡氏菌是其主要病原。鱼诺卡氏菌全基因组生物信息学分析,发现了一个可能靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白——动力蛋白调节蛋白robl/LC7。为了对鱼诺卡氏菌robl/LC7的亚细胞定位和功能进行初步研究,实验对鱼诺卡氏菌robl/LC7进行了基因克隆、真核表达重组质粒构建、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和凋亡检测。结果显示,成功克隆了鱼诺卡氏菌robl/LC7基因并构建了其真核表达质粒p EGFP-robl/LC7和pc DNA-robl/LC7;鱼诺卡氏菌分泌蛋白质谱鉴定证实robl/LC7为分泌蛋白;亚细胞定位研究显示robl/LC7-GFP融合蛋白呈全细胞分布,不与线粒体共定位;凋亡检测发现robl/LC7过表达能诱导FHM细胞凋亡。研究表明,鱼诺卡氏菌robl/LC7是一个不与线粒体共定位的分泌蛋白,其可能通过参与细胞凋亡调控,协助鱼诺卡氏菌在宿主体内生存和免疫逃避,并在鱼诺卡氏菌的致病过程中具有重要作用。     

谷氨酰胺对猪肠道形态和功能的影响及其机制

谷氨酰胺是猪体内最丰富的非必需氨基酸,能够抑制肠细胞凋亡、促进增殖发育维持肠道正常结构,最近研究发现谷氨酰胺促进肠粘膜细胞抗凋亡基因、增殖基因和细胞因子生成可能是其维持肠道正常功能的机制之一。本文综述了谷氨酰胺在肠道中的作用及其机制,并提出了今后研究的方向。     

镉对鲫外周血单个核细胞凋亡的诱导

以Cd2 浓度1.25mg·kg-1腹腔注射染鲫,以富含T、B、NK细胞及单核细胞的鲫外周血单个核细胞(PBMC)为效应细胞,用亚显微形态分析、单细胞凝胶电泳(SCGE)、DNA凝胶电泳和流式细胞术(FCM)等方法进行Cd2 诱导鲫PBMC凋亡的研究。电镜显示染镉细胞的染色质边聚、中聚并向胞浆突出和断裂,胞浆内细胞器结构不清晰并见许多大小不等的空泡;对照细胞的核呈马蹄形,染色质分布均匀,胞浆内细胞器结构清晰可辨。SCGE显示染镉细胞呈现DNA边聚化的彗星小头及DNA片段移动形成的彗星尾,对照细胞的核骨架边缘清晰;染镉处理14、17和21d的细胞凋亡率分别为19.4%、16.4%和5.6%,明显高于对照组(1.1%)(P<0.05)。DNA凝胶电泳显示染镉细胞出现180～220bp整数倍的DNA梯状带,14和17d的梯状带较21d明显;对照细胞的DNA为一条带。FCM显示染镉细胞的亚二倍体峰清晰可见,对照细胞的亚二倍体峰几乎看不见;染镉处理14、17和21d的亚二倍体峰细胞量分别为17.5%、23.6%和8.2%,明显高于对照组(1.4%)(P<0.05)。因此,体内染镉可诱导鲫PBMC凋亡并在14～17d达到峰值,21d时则可能由于DNA的损伤修复而得以缓解,由此推测镉诱导鲫PBMC凋亡是其致细胞病变死亡的重要表现形式之一,低浓度镉致鲫免疫系统损伤,极有可能通过直接诱导免疫细胞凋亡而实现。     

吉富罗非鱼钙敏感受体基因的克隆、表达与其参与调控细胞凋亡的机制

钙敏感受体(calcium-sensing recceptor, CaSR)在 Ca²⁺ 刺激下可参与调控细胞凋亡等生理过程, 在机体适应逆境胁迫中发挥重要作用。为研究吉富罗非鱼(Genetically Improved Farmed Tilapia, GIFT)CaSR 基因的特点及其在缺氧胁迫下参与细胞凋亡的调控机制。本研究利用 RT-PCR 技术克隆了吉富罗非鱼 CaSR cDNA 全长序列, 利用 qRT-PCR 技术分析了该基因在不同组织中的表达模式, 并进一步检测了缺氧胁迫下(0.55 mg/L)肝脏中该基因和细胞凋亡相关基因 mRNA 的表达变化, 同时利用 ELISA 法检测了肝脏中抗氧化酶活性的变化, 以及通过 HE 和 TUNEL染色法分别观察了肝细胞的形态变化和凋亡情况。结果显示, 吉富罗非鱼 CaSR cDNA序列全长 3265 bp, 包括 21 bp 5′非编码区、2823 bp 开放阅读框和 421 bp 3′非编码区, 编码 940 个氨基酸。CaSR 基因 mRNA 在不同组织中均有表达, 其中肌肉中表达量最高, 肾脏次之; 组织切片观察发现缺氧可导致肝脏组织结构损伤, 促进肝细胞凋亡; 与对照组(5.0 mg/L)相比, 缺氧可增强 SOD、CAT 和 GSH-Px 抗氧化酶活性, 上调 CaSR mRNA 的表达, 并引起 Bcl-2、Caspase-3 和 P53 凋亡基因 mRNA 的表达变化。研究结果表明, CaSR 可能通过介导 Ca²⁺调控细胞凋亡, 从而参与吉富罗非鱼的缺氧应对机制。     

草鱼呼肠孤病毒诱导ＦＨＭ细胞发生凋亡的研究

为探究草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)能否引起细胞凋亡,采用GCRV分别感染草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cell,CIK)和胖头鲤细胞(Fathead minnow cell,FHM),在不同时间观察细胞病变效应.结果表明,GCRV能感染这2种细胞并引起细胞病变,且CIK细胞对GCRV更为敏感;GCRV感染可以导致CIK细胞的快速融合并裂解,而FHM细胞感染后则很少有细胞融合;利用DAPI、Annexin V-FITC染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) dUTP nick end labeling,TUNEL]技术进一步证实GCRV能够诱导FHM细胞发生凋亡,但不诱导CIK细胞发生凋亡.本研究发现GCRV可以诱导FHM细胞发生凋亡,并推测GCRV在感染不同类型的细胞时,可以通过不同机制促使细胞死亡,从而为进一步研究GCRV的致病机制提供线索.     

斑点叉尾鮰呼肠孤病毒CCRV诱导CCK细胞凋亡的研究

为研究斑点叉尾(鱼回)呼肠孤病毒(CCRV)诱导斑点叉尾(鱼回)肾脏细胞(CCK)发生凋亡的机理,以CCRV感染的CCK细胞为实验材料,采用Hoechst 33258染色、DNA片段化检测、TUNEL反应、亚G1期细胞检测以及线粒体膜电位变化检测等方法进行实验.感染试验结果显示,病毒感染斑点叉尾(鱼回)肾脏组织细胞后,细胞变圆、皱缩,随后细胞脱落,细胞单层呈网状,感染72 h后出现典型细胞病变效应(CPE);病毒感染48 h后Hoechst 33258染色结果显示,细胞的染色质固缩、核边缘化或破裂,可观察到凋亡小体,细胞凋亡率随时间增加;DNA片段化检测结果显示,病毒感染细胞12 h后细胞基因组DNA出现片段化,随后逐渐增强,72 h达到最高;TUNEL反应结果表明,病毒感染细胞72 h后细胞基因组DNA断裂,有大量游离3’末端自由羟基(-OH)存在.亚G1期细胞检测结果显示,病毒感染48 h后,约53.44％细胞处于亚G1期;利用JC-1检测试剂盒检测病毒感染细胞的线粒体膜电位变化,病毒感染细胞24 h后线粒体膜通透性发生改变,膜电位变化显著.紫外线灭活与热灭活的斑点叉尾(鱼回)呼肠孤病毒不能诱导斑点叉尾(鱼回)肾脏细胞发生凋亡,表明细胞凋亡依赖于病毒复制.     

斜带石斑鱼甘露糖受体基因的克隆表达及其功能

为了研究斜带石斑鱼甘露糖受体(Epinephelus coioides mannose receptor, Ec MR)在抗赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染中的免疫功能,实验成功克隆与表达了EcMR。结果显示,EcMR cDNA全长4 793 bp,共编码1 446个氨基酸。Ec MR的蛋白结构域包括1个信号肽(signal peptide)、1个富含蓖麻类β型三叶草结构域(RICIN)、1个Ⅱ型纤维连接蛋白结构域(FNⅡ)、8个串联的C-型凝集素样结构域(CLECTs)以及1个跨膜结构域(transmembrane region)。实时定量PCR(qRTPCR)和细胞免疫荧光(IF)分析结果显示,Ec MR在斜带石斑鱼的8个组织中均有表达,其mRNA的相对表达量顺序为鳃头肾脑脾脏肝脏外周血心脏肌肉。在研究Ec MR是否参与RGNNV入侵过程中时发现,RGNNV可以在GF-1细胞系中快速增殖,同时显著激活Ec MR的表达。为进一步探究RGNNV对GF-1细胞系的影响,本实验通过双染色法检测了RGNNV感染GF-1细胞系后的细胞凋亡情况,研究表明,RGNNV感染可以促进GF-1细胞系的凋亡,并且细胞凋亡率随着RGNNV感染时间延长而增加。同时,qRT-PCR和酶活性检测结果显示,RGNNV的感染可以显著促进凋亡相关基因的转录水平以及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的酶活性水平。综上所述,本研究成功克隆了EcMR,并揭示了其在RGNNV入侵过程中一定的相关性。本研究结果将为石斑鱼病毒性疾病的防控提供参考。