猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及oppA基因遗传进化分析

【目的】了解福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）的流行及oppA基因遗传进化情况。【方法】本研究采用细菌分离培养、生化试验、16S rRNA PCR扩增测序、PCR荚膜分型、oppA基因克隆及相似性分析、动物回归试验等方法对分离菌株进行鉴定和分析。【结果】本研究共分离到10株菌,分离菌在血平板上形成淡灰白色、湿润光滑、奶油露珠状菌落;分离菌株能酵解蔗糖、果糖、麦芽糖和甘露醇,不能分解葡萄糖、枸橼酸盐、乳糖、硫化氢等,与多杀性巴氏杆菌生化特性基本一致;分离菌株16S rRNA序列与GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌相似性达99.9%以上,10株分离菌均为多杀性巴氏杆菌;PCR荚膜分型显示,6株分离菌为荚膜A型,4株为荚膜D型;基于oppA基因的遗传进化树显示,10株分离菌均位于同一分支内;动物回归试验结果显示,在24 h内攻毒小鼠死亡率较高（21/30）,分离菌有较强的致病力。【结论】福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌流行菌株的荚膜血清型主要是A和D型,且大部分菌株都来源于共同的祖先,本研究结果丰富了猪多杀性巴氏杆菌的流行病学资料,并为该病的防控奠定基础。     

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％;与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％;M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.     

PRV FB弱毒株与FA株gE,gI基因的同源性研究

用PCR方法扩增了PRVFB弱毒株和PRVFA野毒株的gE,gI基因,对FB弱毒株的gE,gI基因进行克隆和测序,并将其与GenBank中收录的PRVFA的gE,gI基因进行了比较。结果发现,PRVFB和PRVFA株的gE基因有2处碱基发生了点突变,同源性为99%;gI基因有7处碱基发生了突变,其中1处发生了3个碱基的插入突变,同源性为98%。表明PRVFB在传代过程中发生了遗传性变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗安全性和免疫原性测定

选用猪繁殖与呼吸综合征病毒福建分离株(PRRSV Fuzhou 01株)为制苗种毒。病毒经Marc 145细胞增殖、超速离心浓缩、甲醛灭活后,分别制成新型佐剂IMS1312灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗,两种疫苗病毒含量约为108.0TCID50.mL-1。30头25日龄的PRRSV抗体阴性的断奶猪被随机分成5组,每组6头,用于检测疫苗的安全性和免疫原性。结果表明两种疫苗首次免疫断奶仔猪后14 d可以检测到抗体,二免14 d抗体水平达到高峰,一免180 d后抗体水平可以维持在1∶320。两种佐剂苗在4℃放置12个月均不分层,并对断奶仔猪具有良好的安全性和免疫原性。     

RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)

根据猪PRRSV的ORF7基因序列,设计并合成了1对引物,以PRRSV RNA为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。应用该方法对病毒细胞培养物进行基因扩增,均获得了分子量为443bp的特异性目的片段,而对PCV2、PRV、CSFV及Marc-145细胞进行同条件检测,结果均为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与文献报道的PRRSV其他毒株序列同源性达92%~98%。敏感性试验表明,该体系可检测到2.39TCID50的PRRSV;对2004~2005年送检的81份临床样品进行检测,阳性率为23.4%。上述研究结果表明,建立的RT-PCR特异性好、敏感性高,可用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和流行病学调查。     

扇贝多肽对氧化所致胸腺细胞凋亡的影响

观察扇贝多肽(Polypeptide from Chlamys ferreri)(PCF)对实验性氧化所致小鼠胸腺细胞凋亡的影响。采用台盼蓝(Trypan Blue)活细胞拒染法在普通光学显微镜下观察细胞的存活率；以四甲基氮唑盐(MTT)法测定细胞的增殖活性；以生化检测(DNA ladder)法观察PCF对细胞DNA片断化的影响；用透射电镜观察细胞的超微形态结构变化。台盼蓝染色法证实PCF能增强细胞的活性并与PCF浓度成正比；MTT法表明PCF不仅能保护细胞免受损伤，而且还能促进细胞的增殖，并有PCF依赖性；生化检测显示PCF能减少细胞凋亡的DNA片断化数目；细胞的超微结构还表明PCF能维持细胞结构的完整性。PCF可明显抑制实验性氧化损伤小鼠胸腺细胞的凋亡并有药物依赖性，而且明显优于维生素C。     

福建省规模猪场伪狂犬病流行病学调查与分析

作者分别应用血清中和试验（SNT）和PCR方法,对福建省近3年来56个规模猪场收集的1470份血清和71个规模猪场采集的136份病料进行了猪伪狂犬病的血清学调查和病原检测。结果表明：在2005年、2006年和2007年,猪伪狂犬病病毒中和抗体合格率：母猪分别为91.5％、89.2%和94.8%;6周龄前猪群分别为75.3%、56.6%和75.5%;6周龄后猪群分别为38%、33.9%和30.7%;被检病料中猪伪狂犬病病毒野毒阳性检出率分别为12.5%、17.4%和16.0%。由此可见,猪伪狂犬病在福建省规模猪场仍未得到完全控制,应加强防控。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

从福州某鸭场大批发病和死亡的15～20日龄雏鸭肝脾中分离到1株病毒，该病毒无血凝性，可使4日龄健康鸭90．6％发病、62．5％死亡，利用Ⅰ型鸭肝炎病毒（DH）标准血清进行鸡胚中和试验和血清被动免疫保护试验，证明该分离的病毒株为I型DHV。     

副猪嗜血杆菌寡肽结合蛋白（OPPA）的序列分析及分子结构模拟

通过研究副猪嗜血杆菌（Haemophiius parasuis,Hps）寡肽结合蛋白（Oligopeptide Binding Protein A,OppA）的生物学特性,为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的研制奠定基础。本试验设计了1对特异性引物,应用PCR方法来扩增副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白的全基因序列,并进行克隆和测序。并且采用生物信息学方法,对Hps的oppA基因核苷酸及其对应氨基酸序列进行比对,选取其中的血清学5型分离株,对其OppA蛋白的分子结构、理化性质及结构功能域、蛋白质二级结构等重要参数进行了预测和分析,并对0ppA蛋白的三级结构进行了同源建模。PCR扩增出1638bp的目的片段;测序结果显示出不同血清型Hps之间oppA基因核苷酸序列相似性有一定的差异,而所对应的氨基酸序列却差异更小;OPPA蛋白的理论等电点为6．45,偏弱酸性;OppA蛋白的二级结构以α螺旋、不规则卷曲和8片层为主要构件;Hps的0ppA蛋白的氨基酸序列与鼠疫耶尔森氏菌2223蛋白的同源性为57．20％,以2223蛋白结构为模板成功构建了Hps的OppA蛋白三维结构分子模型,该OppA蛋白三维结构中与2223蛋白相似,也有3个结构域,在疏水口袋中有1条5肽结构。Hps的OppA蛋白的成功模建为OppA蛋白功能的深入研究提供了参考依据。