创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

蟹源致病性拟态弧菌的粘附及侵袭特性

病原菌对机体的致病作用是由其产生的各种毒力因子共同作用的结果,其中病原菌对组织细胞或粘膜的表面粘附是造成机体感染的首要条件。病原菌的粘附因子主要包括菌毛粘附素和其它非菌毛粘附素(如鞭毛、外膜蛋白和血凝素等),其中以菌毛介导的病原菌对组织细胞的粘附是细菌在体内定居、增殖释放毒力因子发挥致病作用的关键。为了揭示拟态弧菌HX 4的致病机理,以经典粘附模式细胞HEp 2细胞作为体外细胞模型,探讨蟹源致病性拟态弧菌HX 4株的粘附特性以及受体物质和抗全菌抗体对细菌粘附作用的影响,同时采用庆大霉素清洗裂解培养法测定该菌对HEp 2细胞的侵袭力。结果显示,HX 4菌株能粘附HEp 2细胞,对HEp 2细胞具有侵袭力。细菌对HEp 2细胞的粘附方式为集聚性粘附,最佳粘附时间为1h,甘露糖和抗体能显著抑制该菌的粘附,表明HEp 2细胞上含有甘露糖样受体。该菌的粘附素除了主要是菌毛外,可能还含有鞭毛、外膜蛋白、血凝素等多种成分。     

19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析

从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础.根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-Tvector载体筛选阳性重组子进行序列测定.结果显示,OmpK基因分别含有786bp～849 bp的开放读码框,编码261～282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%～100%,推测氨基酸序列的相似性为71%～100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高.序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌.本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性.由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础.     

副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性研究↑（*）

本文对１３株不同来源的副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性进行了比较研究。１３株副溶血弧菌的外膜蛋白有相似的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱。大多数菌株有五条主要的蛋白质，其大致分子量分别为：ａ、６９ｋＤａ；ｂ、６３ｋＤａ；ｃ、４０ｋＤａ；ｄ、３０ｋＤａ；ｅ、２８ｋＤａ。其中蛋白质ｂ是所有菌株共有的。与吸附后的兔抗副溶血弧菌血清Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法结果显示抗血清与多数副溶血弧菌菌株的外膜蛋白有一条共同的免疫反应带，其大致分子量为４４ｋＤａ。     

牙鲆秦皇岛弧菌HQ010712-1外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)2种方法提取秦皇岛弧菌HQ010712-1(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)外膜蛋白,结果显示 Sarkosyl法提取效果较好,且所提取的主要外膜蛋白分子量为102kD、45 kD、39 kD、36 kD、30 kD、28 kD、24 kD、22 kD;为比较该菌株与弧菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)为对照,电泳图谱显示4种弧菌外膜蛋白的分子量主要集中在22～48 kD之间;利用抗秦皇岛弧菌HQ010712-1血清的免疫印迹表明菌株HQ010712-1外膜蛋白中分子量为45 kD、36 kD的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种弧菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为36 kD的反应带为菌株HQ010712-1、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌共有.本研究旨在为进一步筛选和研究致病性弧菌的共同保护性抗原提供参考.     

九孔鲍消化道及养殖水体中弧菌胞外毒力因子的分析

从汕尾健生鲍鱼养殖场成鲍养殖水体和消化道中分离筛选到22株弧菌,其中14株来自成鲍消化道,8株来自养殖水体。本文对这两种不同来源的菌株进行了致病因子(胞外酶及溶血毒素)的分析比较,同时采用API条带法对其进行了种类鉴定。结果发现,消化道中除1株溶藻弧菌和3株最小弧菌外,其余均为河流弧菌;而水体中除副溶血弧菌和创伤弧菌各1株外,其他也均为河流弧菌。实验还发现,在5株胞外酶分泌能力最强的弧菌中,只有Sh031株是副溶血弧菌,另外4株(Bh14、Sh02、Sh08、Sh05)均为的河流弧菌。结果显示,无论是养殖水体还是消化道,河流弧菌都应视为一种海水养殖贝类(鲍)的主要条件致病菌,是能力较强的胞外致病因子生产者。     

菲律宾蛤仔二种I型溶菌酶的重组表达和抑菌活性

为研究病原微生物刺激后，菲律宾蛤仔I型溶菌酶的免疫应答反应，实验采用重组表达技术，从菲律宾蛤仔中得到2种I型溶菌酶的重组蛋白rVpILYZ-1和rVpILYZ-2，发现其均具有较为广谱的抑菌活性；其中，rVpILYZ-1对副溶血弧菌、灿烂弧菌和藤黄微球菌等具较强的抑菌活性，而rVpILYZ-2对副溶血弧菌抑菌活性较强，且二者均通过非酶抑菌活性和胞壁酸酶活性来发挥抑菌作用。结果显示，rVpILYZ-1最适pH和温度分别为6.5和20 ℃，而rVpILYZ-2最适pH和温度则分别为4.5和10 ℃。此外，rVpILYZ-1和rVpILYZ-2均具免疫调理活性，能够促进血细胞对病原菌的吞噬作用。研究表明，VpILYZ-1和VpILYZ-2在菲律宾蛤仔清除病原微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性

分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）主要外膜蛋白（MOMP），通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明，SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中，SDS-PAGE电泳图谱不同，鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD；溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD，其中，45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较，Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后，分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示，兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带，其分子量分别为97kD、51kD和30kD，说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关；兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带，其分子量分别为51kD和27kD，说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关，而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。     

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中溶源噬菌体与其宿主菌致病力的相关性

急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的对虾病害,本研究从患AHPND的凡纳滨对虾样品中分离得到5株副溶血弧菌,采用致AHPND的副溶血弧菌(VPAHPND)的相关质粒的引物AP2进行PCR检测,表明这5株菌中均存在AHPND相关质粒.利用丝裂霉素C进行溶源性噬菌体筛选和噬菌体诱导发现,其中2株副溶血弧菌(20130629002S01和20130726001S01)可能存在溶源性噬菌体感染;从经0.5 μg/ml丝裂霉素C诱导的20130629002S01和20130726001S01中分别分离得到两种噬菌体phage1和phage2.透射电镜观测显示,phage1为有尾噬菌体,phage2为球形噬菌体.将上述5株副溶血弧菌进行卤虫无节幼体人工感染实验,结果显示,它们对卤虫无节幼体均有致病力,且各分离株的毒力表现出显著性差异;20130629002S01和20130726001S01两株带有溶源性噬菌体的副溶血弧菌的致病力显著低于无噬菌体的副溶血弧菌(20130721001S02).本研究结果表明,5株VPAHPND分离株都含有AHPND相关的质粒,表现出显著的毒力差异,可能携带不同的溶源噬菌体,也可能不携带溶源噬菌体,溶源噬菌体与副溶血弧菌各分离株的毒力并无必然相关性.     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达

根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应（PCR）方法，从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEM-Teasy载体，测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列，定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GST-OmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Western-blotting分析表明，它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应，提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。     

Isolation and characterization of fish Aeromonas hydrophila adhesins important for in vitro epithelial cell invasion

The molecular mechanisms involved in the invasion of Aeromonas hydrophila (strain PPD 134/91) into host cells were studied in vitro using a carp epithelial cell line. Bacterial fractions were extracted with potassium thiocyanate (KSCN) to investigate the adhesins involved. Two groups of adhesins were found. The major group was high molecular weight proteins with the largest component being a 43-kDa protein. Amino terminal sequence analysis indicated that this may have been an outer membrane porin. This supports previous suggestions that a 43-kDa outer membrane protein may be important in adhesion of a human isolate of A. hydrophila . The minor group of adhesins were low molecular weight proteins likely to be less effective in mediating bacterial adhesion and invasion into carp epithelial cells.     

Proteomic analysis of the sarcosine-insoluble outer membrane fraction of Flavobacterium columnare

Outer membrane proteins (OMPs) of bacteria are key molecules interacting with the host environment. Flavobacterium columnare, a pathogen-causing columnaris disease of fish worldwide, was studied in order to understand the composition of its OMPs. The sarcosine-insoluble membrane fraction of the OMPs was analysed using sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in combination with reverse-phase high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (RP-HPLC MS/MS). Thirty-six proteins were identified, including proteins involved in cell wall/membrane biogenesis, specific transport of various nutrients and in essential metabolism. The present study is the first report on the OMPs of F. columnare, and may serve as the basis for understanding the pathogenesis of the bacterium.     

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

为研究II型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)病毒样颗粒(viruses-like particles, VLPs)疫苗,本试验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)将编码VP35蛋白的GCRV-S11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA^TM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,本试验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)进行检测。结果显示,GCRV的3个蛋白在sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径大小为65-72nm。本试验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。     

传染性胰腺坏死病毒VP3基因的分段表达及其抗原表位区域分析

采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒(IPNV) VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1 -VP3(L1)、pET32a-VP3( L2)、pGEX-6P1-VP3( L3)和pGE...     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26的毕赤酵母组成型分泌表达

近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。     

Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant subunit injection vaccine expressed in Pichia pastoris

ABSTRACT:   The potentiality of injection vaccine against white spot syndrome virus (WSSV) in crayfish Procambarus clarkii was investigated. WSSV envelope proteins VP19 and VP28 were expressed in yeast Pichia pastoris GS115. The purified recombinant proteins (2 µg/g of crayfish) were injected intramuscularly, and the same dose injected as a booster shot on fifth day after vaccination. The vaccinated crayfish were divided into two even groups and later challenged orally by WSSV-infected dead crayfish muscle (2 g/individual) on the third and 21st days after the booster shot. The relative percent survival (RPS) in the third-day group was the highest in VP28 (91%), followed by VP19 + VP28 (84%), and VP19 (45%). The RPS for the 21st-day group was the highest in VP28 (78%), followed by VP19 + VP28 (76%), and VP19 (17%). Development of vaccine by using recombinant proteins VP19 and VP28 expressed in yeast is feasible.     

斑节对虾细胞周期蛋白B慢病毒载体的构建及对Hela细胞增殖影响

细胞周期蛋白B（Cyclin B）是影响卵母细胞发育成熟的重要基因。文章构建了PmCyB慢病毒表达载体,并和慢病毒包装复合物在293T细胞中包装成慢病毒颗粒。利用包装好的慢病毒颗粒,感染干扰了Cyclin B1基因的Hela细胞,研究了PmCyB对Hela细胞增殖的影响。结果表明,通过siRNA干扰细胞自身的Cyclin B1后,转染对照组病毒液的Hela细胞增殖减缓;同时,干扰后转入含有PmCyB重组慢病毒表达载体,Hela细胞增殖速度明显要高于转染对照组病毒液的Hela细胞的增殖速度。这一结果表明,PmCyB基因的过表达能补偿Cyclin B1缺失导致的细胞增殖减缓的现象,说明PmCyB基因具有细胞周期调控功能,是细胞增殖与分化的重要调控基因,且功能可能与人类的Cyclin B1相似。人类的Cyclin B1是卵母细胞发育成熟的重要基因。由此可以推断,PmCyB基因可能对斑节对虾（Penaeus monodon）卵巢发育成熟起着重要作用。     

鱼肠道弧菌外膜蛋白抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠法和苯甲基磺酰氟法提取鱼肠道弧菌外膜蛋白.SDS-PAGE图谱显示,PMSF提取的鱼肠道弧菌有19条带,Sarkosyl法提取的鱼肠道弧菌有14条带,其中111、105、87、78、61、58、53、48、45、40、36、33、32、31 kD蛋白带为2种方法共同条带,101、55、42、27、25 kD为PMSF法特有条带.此外,以制备的兔抗鱼肠道弧菌全菌血清为第一抗体,应用Western-blotting技术分析了鱼肠道弧菌外膜蛋白的抗原性,结果显示分子量为106、87、61、58、55、42、36、32 kD的8条蛋白带发生了免疫反应.