鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性

分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）主要外膜蛋白（MOMP），通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明，SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中，SDS-PAGE电泳图谱不同，鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD；溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD，其中，45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较，Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后，分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示，兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带，其分子量分别为97kD、51kD和30kD，说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关；兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带，其分子量分别为51kD和27kD，说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关，而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。     

牙鲆秦皇岛弧菌HQ010712-1外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)2种方法提取秦皇岛弧菌HQ010712-1(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)外膜蛋白,结果显示 Sarkosyl法提取效果较好,且所提取的主要外膜蛋白分子量为102kD、45 kD、39 kD、36 kD、30 kD、28 kD、24 kD、22 kD;为比较该菌株与弧菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)为对照,电泳图谱显示4种弧菌外膜蛋白的分子量主要集中在22～48 kD之间;利用抗秦皇岛弧菌HQ010712-1血清的免疫印迹表明菌株HQ010712-1外膜蛋白中分子量为45 kD、36 kD的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种弧菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为36 kD的反应带为菌株HQ010712-1、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌共有.本研究旨在为进一步筛选和研究致病性弧菌的共同保护性抗原提供参考.     

大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的外膜蛋白及其抗原性分析

用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心的方法提取了一株大菱鲆致病性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SR1和其他7株弧菌的外膜蛋白。通过SDS-PAGE图谱分析比较了这8株弧菌外膜蛋白的组成,结果表明,8株弧菌的外膜蛋白电泳一般可得到6-12条条带,其分子量多集中在65-106 kD和28-48 kD,其中36 kD的蛋白带为8株弧菌所共有。用兔抗SR1全菌血清进行Western-blot印迹显示,菌株SR1的外膜蛋白条带中有6条发生了阳性反应,其分子量分别为73 kD、48 kD4、5 kD3、9 kD、36 kD和32 kD。而其他7株弧菌的外膜蛋白与兔抗SR1血清也发生程度不等的阳性反应,这些阳性反应条带的分子量集中在65-73 kD、45-48 kD和36-41 kD之间,其中36 kD的外膜蛋白在8株弧菌中均出现明显的阳性反应,说明36 kD的外膜蛋白是这8株弧菌共有的特异性抗原。     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析

从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础.根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-Tvector载体筛选阳性重组子进行序列测定.结果显示,OmpK基因分别含有786bp～849 bp的开放读码框,编码261～282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%～100%,推测氨基酸序列的相似性为71%～100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高.序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌.本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性.由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础.     

水产动物主要弧菌外膜蛋白结构的比较分析

用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心纯化的方法提取了溶藻弧菌SR1、鱼肠道弧菌HQ010223-1和鳗弧菌S010610-1共3株水产动物致病弧菌及其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs),通过SDS-PAGE分析其外膜蛋白的组成结构。结果表明,3株致病弧菌分别有12、6和6条外膜蛋白带,且分子量主要集中在32~48kD和66~106kD之间。同时,分析其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌共15株细菌外膜蛋白的SDS-PAGE图谱发现,11株弧菌的外膜蛋白图谱比较相似,而与非弧菌属细菌爱德华氏菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌则差别明显,且36kD的外膜蛋白为这11株弧菌所共有,而4株非弧菌属细菌的SDS-PAGE图谱则没有36kD的蛋白条带出现。本试验发现,36kD的外膜蛋白存在于所供试的14株弧菌中,而非弧菌属细菌则没有,说明该蛋白有可能是弧菌特异性的外膜蛋白,可作为弧菌属的标志,对于弧菌鉴定有一定的参考价值。     

不同海洋弧菌中5类溶血素基因的分布及其与溶血活性和磷脂酶活性的相关性

用57株海洋弧菌,包括26株弧菌标准菌株、20株哈维氏弧菌、11株副溶血弧菌(从不同宿主和不同地理环境中分离得到),用PCR法合成5类相应的地高辛标记的溶血素基因探针,利用其进行Southern Blot,检测这5类溶血素基因在57株弧菌中的分布。结果显示,在57海洋株弧菌中,含有TDH、HlyA、TLH、δ-VPH和HLX溶血素基因的菌株分别为2株、2株、49株、3株和30株。另外,1株霍氏格里蒙菌(Grimontia hollisae)和1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)中分别含有2个TDH溶血素基因。用鱼血平板和卵磷脂平板检测57株弧菌的溶血活性和磷脂酶活性,结果表明,弧菌溶血活性和磷脂酶活性与TLH溶血素基因具有显著相关性,与另外4类溶血素基因的关系不明显。     

副溶血弧菌与肝素结合相关黏附蛋白的鉴定

黏附因子在病原菌的致病过程中发挥了重要作用,鉴定新的黏附因子是了解病原菌致病机制的重要手段。本研究中首次发现游离肝素能够竞争性抑制副溶血弧菌与Hela细胞的黏附,表明细胞外基质中的肝素可能是细菌重要的细胞表面黏附受体。进一步利用肝素亲和层析技术垂钓到6种副溶血弧菌的外膜蛋白,并通过基因克隆和原核表达技术成功获得重组的外膜蛋白并对其进行了深入研究。重组蛋白IMPDH、EF-Tu和Opp A可黏附Hela细胞,并可以显著抑制副溶血弧菌与Hela细胞的黏附,说明这3种蛋白可能是其重要的潜在黏附因子。     

不同类型抗菌素对致病性鳗弧菌外膜蛋白表达的影响

摘要：对已分离的1株致病性鳗弧菌W1外膜蛋白图谱进行SDS-PAGE分析，并与8株不同血清型的鳗弧菌外膜蛋白进行比较。结果表明，鳗弧菌W1主要外膜蛋白分别为24kD，38kD，42kD和47kD，主要外膜蛋白图谱与鳗弧菌O1血清型标准菌株VIB1相似。抗生素药敏试验表明该菌对氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶等14种常用药物产生了抗性，只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等9种药物敏感。研究不同浓度的氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶和庆大霉素对鳗弧菌外膜蛋白表达的影响。结果表明，氨苄青霉素、强力霉素和磺胺嘧啶明显地抑制鳗弧菌42kD的主要外膜蛋白的表达，随着抗菌素浓度的增加，该外膜蛋白的表达量逐渐减少甚至消失，而庆大霉素浓度的变化对其表达没有明显影响。对该42kD主要外膜蛋白进行N末端分析表明，其N末端序列为EAPTAINS，与已发表的细菌其他外膜蛋白序列没有同源性。     

对虾养殖池副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药特征、毒力基因分析

为了解对虾养殖池中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐药性和毒力基因的携带情况，2018年从山东4个地区的对虾养殖池收集分离副溶血弧菌，采用Kirby-Bauer纸片法检测其对12种抗生素的耐药性，用PCR方法检测其携带耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)的情况。从对虾养殖池共分离副溶血弧菌50株。药敏实验结果显示，副溶血弧菌对庆大霉素、硫酸新霉素和氨苄西林的耐药情况最为严重，耐药率分别高达98%、90%和86%，对氟苯尼考、氯霉素、头孢他啶等敏感性较高，耐药率分别为10%、10%和20%。88%的菌株具有多重耐药性。毒力基因检测结果显示，所有菌株均不携带tdh基因，4%的菌株表现为trh阳性。本研究表明，对虾养殖水环境中的副溶血弧菌对抗生素的耐药性较为严重，应加强副溶血弧菌的病原学监测，在养殖过程中合理使用抗生素，以实现水产养殖业健康发展。     

Siderophores and related outer membrane proteins in Vibrio spp. which are potential pathogens of fish and shellfish

Abstract. A total of eight reference strains and 43 environmental isolates of Vibrio species that are potential fish pathogens, were assayed for the production and utilization of siderophores. Chemical and biological assays indicated that all species produced phenolate compounds and only some strains of V. cholerae non-O1, V. parahaemolyticus and V. fluvialis produced hydroxamates. Bioassays indicated that all species produced compounds that stimulated the growth of the homologous and the heterologous species in low-iron media. The catechol-type siderophores produced may be functionally related to enterobactin as demonstrated by bioassays with enterobactin-deficient mutants. However, the chromatographic analysis and absorption spectra of supernatants and their extracts showed some differences among catechols excreted by Vibrio species. The hydroxamate compounds produced by some strains of V. fluvialis and V. parahaemolyticus were different from the aerobactin. The synthesis of iron-regulated outer membrane proteins was also examined in representative strains of each species. The molecular size of the main induced proteins ranged between 74 and 95kDa, and were relatively species specific.     

Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida: correlation of protein patterns, antibiotic resistance, exoprotease activity, haemolysis and pathological lesions produced in vivo

Abstract. A collection of 130 strains of the bacterial fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida isolated from diseased salmonids in Denmark, Norway, North America and Scotland has been characterized with regard to protein patterns, antibiotic resistance and exoprotease activity. Whole cell and outer membrane protein profiling could distinguish three different profiles in A. salmonicida. Eight outer membrane proteins were demonstrated (49, 40, 38, 37, 33, 31, 30 and 29 kDa). One protein profile was deficient in a 38 kDa outer membrane protein and instead contained an outer membrane protein of 37 kDa which was not detectable among the other protein profiles. Strains with the 37 kDa outer membrane protein showed multiple low-level antibiotic resistance towards cephalothin, penicillin, chloramp-henicol, tetracycline and quinolones. In addition, these strains were exoprotease deficient. Strains with the 37 kDa protein were unable to degrade cattle and trout serum proteins and displayed a delayed degradation of casein. Haemolysis on cattle blood agar plates was similarly delayed. In vivo examination of extracellular products from a normal protein profile strain and one with the 37 kDa outer membrane protein demonstrated major differences in pathological effects in rainbow trout. The strain possessing the 37 kDa outer membrane protein produced almost no pathological effects while the normal protein profile strain produced typical furuncles.     

鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸研制

鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)可引起多种养殖鱼类发病死亡, 给鱼类养殖业带来严重经济损失。为解决养殖过程中鱼肠道弧菌的现场快速检测问题, 本研究研制了鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸。通过制备兔抗鱼肠道弧菌多克隆抗体, 间接ELISA分析发现其与鱼肠道弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物及全菌破碎蛋白发生阳性免疫反应, 与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的4种抗原蛋白发生程度不等的免疫交叉反应。制备胶体金标记鱼肠道弧菌抗体, 确定了鱼肠道弧菌4种抗原蛋白的划线浓度, 以4种抗原蛋白作为4条检测线, 羊抗兔IgG作为质控线, 基于竞争法免疫层析技术研制出鱼肠道弧菌快速检测试纸。对鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌的检测结果显示, 该试纸可以准确鉴别出鱼肠道弧菌, 并能判别其他病原菌的交叉反应。该试纸对鱼肠道弧菌的最低检测限为5×10⁵ CFU/mL, 检测耗时为10 min。对患病牙鲆组织的检测结果显示, 该试纸与ELISA结果一致, 表明具有较好的检测准确性。本研究为水产养殖现场的鱼肠道弧菌快速、准确检测提供了有力工具。     

鲍养殖水体中致病性弧菌的调查

在18份鲍鱼养殖厂的各种水样和不同生长期的鲍样品中,共分离出17株弧菌:溶藻性弧菌11株,副溶血弧菌3株,霍乱弧菌2株,拟态弧菌1株。其中,溶藻性弧菌分布比较广,存在于各种样品;副溶血弧菌主要分布于鲍的肠道内;而非O1 O139群霍乱弧菌和拟态弧菌则分布于源头水中。鲍养殖水体中细菌总数的计数可以作为监测细菌性病害的指标之一。副溶血弧菌在鲍肠道内的高检出率提示鲍与副溶血弧菌的关系值得深入研究。     

引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型

针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),仅与库中ST415及ST975同源性较高。目前,急性肝胰腺坏死致病株的9种ST型可归为2个克隆组和5个单体。经系统发育树进一步分析可知新序列型ST1710与单体ST975遗传关系相近。本研究首次报道中国AHPND分离株的序列型,丰富了PubMLST数据库,并为其遗传进化研究奠定了理论基础。     

斜带石斑鱼3种致病性弧菌的分子生物学鉴定

从患病斜带石斑鱼分离到3株病原菌EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801，经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类。为了进一步确定其分类地位，测定了3株病原菌的16SrRNA和HSP60(heat shock protein，HsP60)基因部分序列。16SrRNA基因系统进化分析表明，3株病原菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌亲缘关系较近，相互之间同源性均大于98．6％，差异不明显。HSP60基因序列分析表明，菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801 HSP60基因序列分别与哈维氏弧菌(AF230934)、溶藻弧菌(Ab230931)、副溶血弧菌(AF230951)HSP60基因的同源性最高，依次为95．7％、99．8％和99．8％，而与其它弧菌HSP60基因的同源性均低于90．6％，3株病原菌相互之间的同源性低于91．0％。HSP60基因构建的系统进化树表明，EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801分别与Vibrio harveyi、Vibrio alginolyticus、Vibrio parahaemolyticus聚类。综合上述结果，菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801可分别鉴定为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌。结果表明，HSP60基因比16SrRNA基因更适合用于海水鱼致病性弧菌种问的分类研究。     

天津地区南美白对虾弧菌病主要病原菌耐药性调查

采用K-B纸片扩散法和微量稀释法对从天津地区养殖的南美白对虾(Penaeus vannamei)中分离的弧菌进行耐药性调查,结果显示2020年在养殖季节从天津市患病的南美白对虾中共分离出弧菌33株,其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、创伤弧菌7株、霍乱弧菌3株。在天津市南美白对虾以副溶血弧菌污染最为严重,约占总数的45%左右。药敏结果显示分离的33株弧菌对2种及2种以上药物耐药的有27株,约占总数的81.8%,说明天津地区弧菌已经出现了多重耐药的现象;通过对33株弧菌对药物的MIC值测定,33株弧菌对恩诺沙星、氟甲喹和盐酸多西环素比较敏感,对磺胺类药物比较耐药。结果提示应加强对天津地区南美白对虾弧菌病主要病原菌耐药性监控。