鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性

分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）主要外膜蛋白（MOMP），通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明，SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中，SDS-PAGE电泳图谱不同，鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD；溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD，其中，45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较，Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后，分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示，兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带，其分子量分别为97kD、51kD和30kD，说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关；兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带，其分子量分别为51kD和27kD，说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关，而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。     

大菱鲆致病性溶藻弧菌SR1的外膜蛋白及其抗原性分析

用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心的方法提取了一株大菱鲆致病性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SR1和其他7株弧菌的外膜蛋白。通过SDS-PAGE图谱分析比较了这8株弧菌外膜蛋白的组成,结果表明,8株弧菌的外膜蛋白电泳一般可得到6-12条条带,其分子量多集中在65-106 kD和28-48 kD,其中36 kD的蛋白带为8株弧菌所共有。用兔抗SR1全菌血清进行Western-blot印迹显示,菌株SR1的外膜蛋白条带中有6条发生了阳性反应,其分子量分别为73 kD、48 kD4、5 kD3、9 kD、36 kD和32 kD。而其他7株弧菌的外膜蛋白与兔抗SR1血清也发生程度不等的阳性反应,这些阳性反应条带的分子量集中在65-73 kD、45-48 kD和36-41 kD之间,其中36 kD的外膜蛋白在8株弧菌中均出现明显的阳性反应,说明36 kD的外膜蛋白是这8株弧菌共有的特异性抗原。     

水产动物6种主要病原菌与抗血清的免疫交叉反应

采用ELISA、试管凝集、Western-blot等方法,分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌(V. paraheamolyticus)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)等水产养殖中主要病原细菌与抗血清之间的免疫交叉反应.结果表明,弧菌属细菌之间的交叉反应程度比较大,而与其他两属的细菌之间存在的交叉反应程度小,或不存在交叉反应;Western-blot分析结果显示,哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌和副溶血弧菌抗血清分别与其他3种弧菌在分子量为135.6 kD和121.5 kD;95.6 kD,48.4 kD,39.2 kD和34.9 kD;55.1 kD的蛋白带处存在交叉反应,而这些分子量的蛋白带与其他两属的抗血清均不发生反应.     

水产动物主要弧菌外膜蛋白结构的比较分析

用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心纯化的方法提取了溶藻弧菌SR1、鱼肠道弧菌HQ010223-1和鳗弧菌S010610-1共3株水产动物致病弧菌及其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs),通过SDS-PAGE分析其外膜蛋白的组成结构。结果表明,3株致病弧菌分别有12、6和6条外膜蛋白带,且分子量主要集中在32~48kD和66~106kD之间。同时,分析其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌共15株细菌外膜蛋白的SDS-PAGE图谱发现,11株弧菌的外膜蛋白图谱比较相似,而与非弧菌属细菌爱德华氏菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌则差别明显,且36kD的外膜蛋白为这11株弧菌所共有,而4株非弧菌属细菌的SDS-PAGE图谱则没有36kD的蛋白条带出现。本试验发现,36kD的外膜蛋白存在于所供试的14株弧菌中,而非弧菌属细菌则没有,说明该蛋白有可能是弧菌特异性的外膜蛋白,可作为弧菌属的标志,对于弧菌鉴定有一定的参考价值。     

鱼肠道弧菌外膜蛋白抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠法和苯甲基磺酰氟法提取鱼肠道弧菌外膜蛋白.SDS-PAGE图谱显示,PMSF提取的鱼肠道弧菌有19条带,Sarkosyl法提取的鱼肠道弧菌有14条带,其中111、105、87、78、61、58、53、48、45、40、36、33、32、31 kD蛋白带为2种方法共同条带,101、55、42、27、25 kD为PMSF法特有条带.此外,以制备的兔抗鱼肠道弧菌全菌血清为第一抗体,应用Western-blotting技术分析了鱼肠道弧菌外膜蛋白的抗原性,结果显示分子量为106、87、61、58、55、42、36、32 kD的8条蛋白带发生了免疫反应.     

哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀红细胞的溶血活性;将哈氏弧菌在不同温度下(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养36h和25℃下培养不同时间(12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h)后提取其胞外产物并对其蛋白质含量进行测定;经SDS-PAGE分离粗提胞外产物中蛋白成分,并用Dot-ELISA和Western-blot方法对其成分进行分析。实验结果显示,该胞外产物对红鳍东方鲀具有致病性;具有淀粉酶和酪蛋白酶活性,不具有卵磷脂酶、脂肪酶和明胶酶活性;对红鳍东方鲀红细胞有溶血活性,对绵羊红细胞无溶血活性;胞外产物蛋白质总含量在35℃培养36h后出现高值,与温度变化无明显相关性;25℃下培养24h、36h和48h的粗提胞外产物经SDS-PAGE分离,有3条蛋白质条带最明显,分子量分别约为31kD、38kD、60kD;其中分子量约为60kD蛋白条带,经Dot-ELISA和Western-blot方法证实其为半胱氨酸蛋白酶-1。根据以上结果认为哈氏弧菌H-06091菌株胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性研究↑（*）

本文对１３株不同来源的副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性进行了比较研究。１３株副溶血弧菌的外膜蛋白有相似的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱。大多数菌株有五条主要的蛋白质，其大致分子量分别为：ａ、６９ｋＤａ；ｂ、６３ｋＤａ；ｃ、４０ｋＤａ；ｄ、３０ｋＤａ；ｅ、２８ｋＤａ。其中蛋白质ｂ是所有菌株共有的。与吸附后的兔抗副溶血弧菌血清Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法结果显示抗血清与多数副溶血弧菌菌株的外膜蛋白有一条共同的免疫反应带，其大致分子量为４４ｋＤａ。     

与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌有关的6.0 kD 血蓝蛋白降解肽段

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用人工感染、Tricine-SDS-PAGE、Western-blotting、MALDI-TOF/TOF、抑菌实验等方法对血蓝蛋白小分子降解肽段进行研究。结果发现,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)刺激对虾24 h后,与对照组相比,其血淋巴中新出现5个分子量为6.0~31.0 k D的与兔抗血蓝蛋白抗体呈阳性的小分子条带。其中,分子量为6.0 k D的a条带(命名为HMCp6肽段)与凡纳滨对虾血蓝蛋白具有高度同源性,对副溶血弧菌具有明显的抑菌活性,与对照组相比,存在极显著性差异(P0.01)。由此说明,HMCp6应该是对虾感染副溶血弧菌后所产生的一种新的小分子降解肽段,推测其在对虾抗感染防御中发挥重要作用。     

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测.     

淋巴囊肿病毒结构蛋白及其抗原性分析

病鱼为威海水产养殖场感染淋巴囊肿病的牙鲆（Paralichthys olivaceus）,收集病鱼的囊肿组织,匀浆破碎,采用差速离心和蔗糖密度梯度离心方法,分离纯化淋巴囊肿病毒粒子.负染后,电镜观察证实获得的病毒纯度高,杂质极少,病毒粒子呈近似于圆形的多角形,结构完整.纯化的淋巴囊肿病毒粒子经SDS-PAGE,硝酸银染色后,电泳图谱清晰显示病毒结构蛋白带共有22条,且分子量主要集中在123～26 kD.应用Western blotting法分析病毒结构蛋白的抗原性,结果显示,分子量分别为123.55 kD、65.292 kD和54.438 kD的3条蛋白带发生了免疫反应,其中分子量为65.292 kD的蛋白带反应强度明显高于其他2条蛋白带.本研究旨为确定淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白提供基础依据.[中国水产科学,2006,13（3）：415-420]     

不同类型抗菌素对致病性鳗弧菌外膜蛋白表达的影响

摘要：对已分离的1株致病性鳗弧菌W1外膜蛋白图谱进行SDS-PAGE分析，并与8株不同血清型的鳗弧菌外膜蛋白进行比较。结果表明，鳗弧菌W1主要外膜蛋白分别为24kD，38kD，42kD和47kD，主要外膜蛋白图谱与鳗弧菌O1血清型标准菌株VIB1相似。抗生素药敏试验表明该菌对氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶等14种常用药物产生了抗性，只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等9种药物敏感。研究不同浓度的氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶和庆大霉素对鳗弧菌外膜蛋白表达的影响。结果表明，氨苄青霉素、强力霉素和磺胺嘧啶明显地抑制鳗弧菌42kD的主要外膜蛋白的表达，随着抗菌素浓度的增加，该外膜蛋白的表达量逐渐减少甚至消失，而庆大霉素浓度的变化对其表达没有明显影响。对该42kD主要外膜蛋白进行N末端分析表明，其N末端序列为EAPTAINS，与已发表的细菌其他外膜蛋白序列没有同源性。     

河蟹精子膜蛋白的生化特性

利用含1% TritonX-100和0.1%SDS的提取缓冲液提取河蟹(Eriocheir sinensis)精子膜蛋白。对所得的精子膜蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示,河蟹的精子含有12种不同的膜蛋白组分。对这些精子膜蛋白组分的生化特性进行分析,结果表明,河蟹精子膜蛋白是1组呈酸性的低分子量糖蛋白,分子量为21.6～75.5kD,等电点在4.8左右。     

豚链球菌和停乳链球菌类M蛋白及其抗原性分析

分别用热酸抽提法、碱抽提法和胃蛋白酶消化法分离豚链球菌NUF849的类M蛋白，通过SDS-PAGE和Western-blotting印迹法分析比较三种方法所提类M蛋白的组成和抗原性差异。结果表明，热酸抽提法分离制备的类M蛋白得率和纯度都较其它两种方法高，蛋白的抗原性保持较好。采用热酸提取法提取5株豚链球菌NUF633、NUF693、 NUF701、 NUF812、 NUF849和2株停乳链球菌SD、L2的类M蛋白，其SDS-PAGE图谱明显不同，种间差异明显, 豚链球菌主要类M蛋白的分子量分别为60、48、37、30、27、24和15kDa，停乳链球菌主要类M蛋白的分子量分别为68、48、42、37、29、26、23、21、19、17、15、14和11kDa。Western-blotting结果显示，兔抗豚链球菌血清可与豚链球菌的两条类M蛋白带结合，分子量分别为60和37kDa；与停乳链球菌的两条类M蛋白带结合，分子量为68和37 kDa。两种链球菌主要类M蛋白组成及其抗原性差异明显。     

Yersinia ruckeri produces four iron-regulated outer membrane proteins but does not produce detectable siderophores

Abstract. The expression of iron-regulated outer membrane proteins (OMPs) was examined in 36 isolates of Yersinia ruckeri selected to represent a range of biotypes, serotypes and OMP-types. Iron-restricted growth was achieved in tryptone soya broth by chelation with 200 μm α,α'-dipyridyl, although similar results could be achieved with 25 μm transferrin or 280 μM ethylenediaminedihydroxyphenylacetic acid (EDDA). During growth under iron-restricted conditions, all 36 isolates produced four additional outer membrane proteins of molecular weights 72, 69·5, 68 and 66 kDa. Expression of these proteins was repressed by the addition of 100 μm FeCl₃ to the growth medium, confirming that the proteins were iron-regulated. The facts that all of the isolates examined possessed the same four iron-regulated OMPs, and that the plasmid content of different serotypes is known to vary indicated that production of these proteins is probably chromosomally mediated and not plasmid-mediated. Production of siderophores was not detected in low iron media and suggested a direct iron-uptake mechanism for this organism.     

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株胞外产物及分泌性蛋白的分离与特性分析

本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus(♀)×Epinephelus lanceolatus(♂)]幼鱼“皮肤溃疡病”的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋白.应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术,对纯化的胞外产物和3种主要的分泌性蛋白进行了特性分析与鉴定.结果显示,哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(Extracellular products,ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性,无脲酶活性.ECPs对羊红细胞无溶血性,对斑马鱼(Danio rerio)的半数致死剂量(LD50)为19.55μg/g鱼体重.从ML01株中分离到3种主要的分泌蛋白P42、P36、P31,其分子量分别为42、36、31 kDa.经质谱鉴定和分析,这3种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白OmpU和OmpN,以及一种功能未知的蛋白.利用同源克隆,成功地从ML01株基因组中扩增到了P42、P36、P31的基因.序列测定和比对结果显示,ML01株的这3个基因与哈维氏弧菌ATCC 33843(GenBank CP009467)的相应基因相比,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列的相似性分别为97.08％、100％、99.67％,其编码的多肽序列的相似性分别为99.71％、100％和99.93％.本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理、研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值.     

病毒铺膜印迹技术分离牙鲆鳃细胞上的淋巴囊肿病毒结合蛋白

利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白,结果显示在FG细胞膜上有分子量为135 kD的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合;对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE与双向电泳,发现135 kD蛋白由3个蛋白组成,分子量分别为58.3 kD、44.6 kD及37.6 kD;135 kD蛋白SDS-PAGE的VOPBA显示,仅出现37.6 kD的蛋白带,而58.3 kD、44.6 kD蛋白皆不与淋巴囊肿病毒结合。结果表明牙鲆FG细胞上135 kD蛋白是淋巴囊肿病毒的结合蛋白,其37.6 kD蛋白具有病毒结合活性。