水稻β-石竹烯合成酶基因OsCAS的克隆鉴定、原核表达及其遗传转化

    为阐明水稻β-石竹烯在调节水稻、害虫及其天敌相互关系中的作用,克隆鉴定了一个水稻β-石竹烯合成酶基因OsCAS,并对其原核表达与遗传转化进行研究.该基因的cDNA全长1731 bp,包含一个1728 bp的开放阅读框,编码一个由576个氨基酸组成的蛋白,预测分子量66.5 kDa.系统进化树分析表明,水稻OsCAS基因编码蛋白的氨基酸序列与同为单子叶植物玉米的β-石竹烯合成酶氨基酸序列同源性达99%,而与其他植物(拟南芥、青篙、黄瓜)的同源性仅51%.褐飞虱为害和茉莉酸处理能明显上调OsCAS基因的表达水平.同时原核表达了OsCAS基因,并利用农杆菌转化系统获得OsCAS基因过量表达和RNAi的水稻品系,为分析OsCAS基因的生化与生物学功能奠定了基础.     

藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究

[目的]研究MSTN基因在藏系绵羊不同年龄、不同组织的表达差异。[方法]根据GenBank已发表序列（NM_001009428．1）设计l对引物,以藏系绵羊组织总RNA为模板,采用实时荧光定量PCR技术（QRT—PCR）分析了MSTN基因在不同年龄阶段的真胃、瘤胃、腿肌和心肌中的基因表达量。[结果]经过内参基因校正后,综合4个组织分析,MSTN基因在6月龄藏系绵羊的相对表达量最高,是12月龄藏系绵羊的2．52倍,是羔羊的2．24倍,是9月龄的1．30倍（尸〈O．05）。且MSTN基因在腿肌中的表达量最高,在其他组织几乎未表达,在腿肌中的表达量是其瘤胃的3984．78倍,是心肌的602．69倍（P〈0．01）。[结论]为MSTN蛋白抗体的正确利用奠定了基础。     

柞蚕性信息素合成相关基因的表达研究

[目的]明确与性信息素合成相关基因的组织分布及其在性腺中的发育表达。[方法]利用荧光定量PCR方法,对柞蚕乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸、醇脱氢酶、酯酶、脂肪酶基因在不同组织分布及性腺中的发育表达进行分析。[结果]乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸2个基因在性腺中的表达量显著高于其他组织;醇脱氢酶、酯酶和脂肪酶3个基因在中肠或脂肪体等组织中表达量高于性腺。乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸、醇脱氢酶、脂肪酶4个基因在羽化后2 d性腺中的表达量显著高于羽化前2 d。酯酶基因在羽化后2 d性腺中的表达量显著低于于羽化前2 d。[结论]明确了柞蚕性信息素合成相关的5个基因的组织分布和发育表达,为进一步研究这些性信息素合成相关基因的功能奠定基础。     

水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式

为了探明盐敏感相关基因[OsSsr1（Oryza sativa L.salt-sensitive related gene 1,GenBank登录号为NM₀01065574）]的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro数据库和Real-time PCR对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2 004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质,该蛋白质N端含有一个信号肽;其启动子序列包含TGACG-motif、ABRE、TCA-element和W box等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP融合表达显示,OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro数据库中数据分析表明,OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,胚中的表达量最低。Real-time PCR结果表明,OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA和ABA的诱导上调。这些结果显示,OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。     

2个育性恢复基因Rf1a和Rf1b在红莲型水稻中的表达量分析

[目的]探究红莲型水稻细胞质雄性不育(CMS)与不同恢复基因之间的作用模式。[方法]利用特异性引物结合荧光定量PCR技术,在红莲型水稻近等恢复基因系L-Rf5、L-Rf6,恢复系9311和不育系粤泰A(YTA)中检测2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的表达量。[结果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表达,而Rf1b只能在部分材料或部分组织中表达。对同一时期二者的表达量分析发现,L-Rf5和9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b,L-Rf6叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。[结论]该研究结果对研究红莲型恢复系的遗传多样性具有一定的参考价值。     

相对定量法分析小鼠CRBN基因表达

[目的]研究CRBN基因与常染色体隐性遗传非综合征轻型精神发育迟滞（ARNSMR）的关系,探讨小鼠CRBN基因mRNA在不同组织中的表达情况。[方法]应用RT-PCR和Real-time PCR技术,研究了小鼠CRBN基因在肺、肝、心脏、肾和大脑中的表达情况。[结果]小鼠CRBN基因mRNA在肺、大脑中表达量较高,在心脏中表达量最低。[结论]小鼠CRBN基因广泛表达于不同组织,除了与学习、记忆功能相关外,可能还有其他功能。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

水稻ISA1基因的克隆与分析

[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,采用半定量RT-PCR技术分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[结果]水稻淀粉去分支酶1cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～83.3%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12d胚乳中的表达量最大。[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础。     

干旱胁迫对分蘖期转基因水稻抗旱性生理生化指标的影响

[目的]通过比较野生型日本晴株系水稻WT和OsCAS基因过表达株系水稻777在分蘖期的抗旱性生理生化指标,分析OsCAS基因高表达株系水稻的抗旱能力。[方法]用10%和15%的PEG模拟干旱胁迫,测定2种株系水稻的CAT、POD和SOD活性及MDA和Pro含量。[结果]在10%PEG处理下,WT和777的3种保护酶活性均有增加;在15%PEG处理下,WT的3种保护酶活性明显降低,777的3种保护酶却能够保持相对较高的活性;此外,WT和777的MDA和Pro含量都随干旱胁迫程度的加深而增加,在同一胁迫条件下WT的MDA和Pro含量要明显高于777的。[结论]OsCAS基因高表达株系777在分蘖期较WT对干旱有较强的抗性,特别是在严重干旱胁迫(15%PEG)时优势尤为明显。     

水稻3型金属硫蛋白基因的分离和表达研究

[目的]对从水稻幼苗中分离的2个3型金属硫蛋白基因OsMT-I-3a和OsMT-I-36的结构进行了分析,并对其表达模式进行了检测。[方法]利用Blast搜索水稻数据库,设计引物并利用RT—PCR的方法克隆OsMT-I-3基因cDNA全长。通过多重比对等方法对其基因和蛋白结构进行了分析。利用Northem杂交对这两个基因的组织表达模式和环境应答模式进行了检测。[结果]OsMT-I-3a和OsMT-I-3b分别编码62和65个氨基酸的多肽,具有典型的3型金属硫蛋白的半胱氨酸分布模式。OsMT-I-3a基因在叶片中没有检测到表达,OsMT-I-3b在叶片中高表达,且各种非生物胁迫因素会影响两种基因的表达模式。[结论]I类3型2个水稻MT基因可能参与水稻多种环境胁迫的信号通路,在水稻抗非生物胁迫过程中起作用。     

转基因抗虫水稻中BT蛋白表达量的研究(英文)

对转基因抗虫水稻中Bt蛋白表达量进行研究。[方法]应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测转基因抗虫水稻生同生长期不同部位的Bt蛋自表达量。[结果]转基因水稻灌浆期不同组织中Bt蛋白表达绝对含量的高低顺序为:叶片>未成熟种子及颖壳>根>茎杆;在水稻不同的生长发育(分蘖期、抽穗期和灌浆期)阶段,转基因Bt水稻中Bt蛋白的含量有一些变化;一般在水稻生长后期Bt蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。[结论]该试验对田间害虫的防治以及转基因水稻的育种都具有重要意义。     

水稻RSSG58的进化分析及其拟南芥同源基因ATG58的组织表达模式

[目的]查找水稻RSSG58在拟南芥中的同源基因并观察其组织表达模式。[方法]利用相关基因信息学网站构建水稻RSSG58的基因进化树,构建其同源基因ATG58::GUS定位载体转入拟南芥,观察分析ATG58的组织表达模式。[结果]进化树和序列对比发现ATG58与RSSG58具有较高的序列相似性,GUS定位遗传材料显示ATG58在多种组织都有表达,在生长发育早期的根、子叶、下胚轴、胚芽表达量相对较高,在生殖发育阶段的花苞和花药内优势表达,ATG58与RSSG58具有相似的GUS定位组织表达模式。[结论]ATG58是水稻RSSG58的同源基因,二者组织表达模式一致,这些结果为深入研究拟南芥ATG58和水稻RSSG58在雄配子发育过程中的作用及机制提供了基础资料。     

水稻ISA1基因的克隆与分析(英文)

[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,胚乳总RNA提取参照Bioteke公司植物多糖多酚总RNA提取试剂盒说明书,用琼脂糖凝胶和Nano-drop检测RNA纯度和浓度。完整性和纯度较好的RNA样品逆转录合成cDNA第1链。根据已发表的水稻ISA1基因序列设计引物IsoaF1和IsoaR1,用于扩增包含全长ORF在内的ISA1cDNA序列。利用TakaraLAPCR试剂在25μl的体系中进行PCR反应。目标片段经切胶回收后连接到pGEM-Teasy载体,转化后进行测序鉴定。利用DNAstar进行序列分析和同源性比对,基因结构与染色体定位分析采用Gramene数据库,核酸和蛋白质序列BLAST检索采用NCBI数据库。利用ClustalW比对和NJ方法在MEGA4中构建系统进化树。利用半定量RT-PCR分析ISA1基因在水稻不同组织(叶、根、茎和胚乳)以及在不同灌浆期胚乳(灌浆3～24d)中的表达情况。[结果]水稻淀粉去分支酶1cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基ISA1基因位于第8号染色体,由18个外显子组成;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～82.5%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12d胚乳中的表达量最大。[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础。     

水稻WNK mRNA在水稻根中的表达

[目的]在对OsWNK基因的生化特性有了一定了解的基础上,研究OsWNK在水稻根组织的表达,为进一步研究基因OsWNK的功能奠定基础。[方法]利用RNA原位杂交技术,通过制备OsWNK基因的正反义地高辛标记的RNA探针,与水稻根内靶基因转录表达产物进行原位杂交定位。[结果]在根尖生长点部位的OsWNK表达最旺盛,而在伸长区的细胞中,OsWNK的表达量很低。另外,在根冠中几乎没有OsWNK的表达。[结论]OSWNK在根尖生长点的大量分布说明仍聊忧在植物快速生长的组织和细胞中表达比较高,推测此基因可能与生长点细胞频繁的细胞分裂有关。     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

半定量RT-PCR法检测SPRN基因在小鼠各组织中的mRNA表达

[目的]研究SPRN基因在不同组织中的表达水平和机制。[方法]选择3种不同品系的小鼠为试验材料,利用半定量RT-PCR方法,测定不同品系小鼠各组织中SPRN基因的mRNA表达水平,并对其循环次数进行研究。[结果]SPRN基因主要在脑组织中表达,在肺脏和胃中表达量较低,而在淋巴结和脾脏中仅有微量的表达;半定量RT-PCR体系的最佳扩增循环数为23。[结论]成功地建立了检测SPRN基因mRNA表达的半定量RT-PCR方法,该方法具有简便、快速、准确和精密度高等优点。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因表达载体的构建

[目的]构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[方法]利用长片段PCR在抗白叶枯病水稻品种扎昌龙中扩增长10.6 kb的候选基因,将其通过Asc I单酶切克隆至植物表达载体pCAMBIA1300中,并对阳性克隆进行质粒PCR、酶切检测和测序分析。[结果]试验成功构建了水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[结论]该研究为进一步研究Xa31(t)基因的功能奠定了基础。     

不同日龄大白猪视黄酸γ基因的表达研究

[目的]探索不同日龄大白猪视黄酸γ基因的表达规律。[方法]以大白猪为试验材料,采用RT-PCR方法对其RARγ基因在1日龄9、0日龄1、80日龄2、70日龄和360日龄的心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫、卵巢共11个组织的表达情况进行了研究。[结果]在大白猪的整个生长发育期内,RARγ基因在其子宫和卵巢中持续表达,而且在子宫中的表达量一直持续较高,且不同组织间的表达量差异不明显。在360日龄时所检的11个组织均表达该基因,且表达量较高。[结论]该研究为进一步探讨RARγ基因在猪体内运载视黄酸过程中所起的作用及其他生理功能奠定了基础。