分子标记辅助构建同质同核近等基因恢复系L-Rf5

红莲型水稻恢复系9311中有2个红莲型恢复基因Rf5和Rf6,不育系YTA中有2个不育基因orfH79和orf216;为了研究2个恢复基因与2个不育基因之间的互作关系,将红莲型水稻不育系YTA与恢复系9311杂交,杂种后代再以YTA为轮回亲本回交8代;根据Rf5基因序列设计特异分子标记,并对L-Rf5进行检测,结合花粉镜检结果,筛选出只含Rf5的纯合株系,多代自交后其表型一致,说明纯合株系L-Rf5构建成功;对近等基因恢复系的不育基因orfH79和orf216的表达量进行分析,结果显示:L-Rf5中orfH79的表达量较YTA明显下降;纯合的L-Rf5比杂合的L-Rf5不育基因orfH79的表达量稍低;L-Rf5中orf216的表达量较YTA下降并不明显。同时克隆了YTA、9311、近等基因恢复系中Rf1B序列,发现它们之间没有差异。     

水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf6功能标记开发及微核心种质中Rf6基因的筛选

核恢复基因Rf6是红莲型杂交水稻特有的新恢复基因,为了寻找更多具有Rf6恢复基因的种质,以扩展红莲型杂交水稻的恢复系来源,组配更多优良杂交品系,利用Rf6及其等位基因的序列差异,开发Rf6基因的功能标记,并利用该标记对中国水稻微核心种质进行PCR扩增,筛选具有Rf6恢复基因的种质。结果表明,在324 bp插入片段(Rf6较其等位基因插入324 bp)两侧设计引物(正向引物:5'-ATGACAAGAGGACCAGCGATGCAATGG-3',反向引物:5'-ATTCTTGCAGAGATAGACCATGAGCGTG-3'),利用该引物可扩增出条带清晰且无杂带的差异片段,可用于Rf6基因的鉴定。利用该标记在197份中国水稻微核心种质中筛选出22份具有Rf6恢复基因的种质,可为拓宽红莲型杂交水稻的恢复系来源提供材料。     

水稻新型胞质不育系L-orfH79与其同核异质YTA的比较

[目的]验证新型细胞质不育系L-orfH79与其同核异质的近等基因系HL-CMS YTA的区别。[方法]用orfH79和orf290这2种分子标记对L-orfH79和YTA进行分子鉴定,并比较其花粉染色特性、花粉育性、结实率及orfH79表达量。[结果]分子标记鉴定结果显示L-orfH79只含有不育基因orfH79、不含有orf290,YTA同时含有orfH79和orf290。L-orfH79花粉的淀粉沉积比YTA更少,L-orfH79花粉大小均匀,而YTA的花粉形态不一。L-orfH79花粉育性、套袋结实率及自然结实率(都低于10%)略高于YTA(都低于5%)。当L-orfH79中引入恢复基因Rf5或者Rf6后花粉形态和颜色都恢复正常。抽穗期L-orfH79剑叶中的orfH79表达量低于YTA,在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后会减少orfH79的表达量。[结论]L-orfH79是不同于YTA的新型细胞质雄性不育系,L-Rf5、L-Rf6可作为其恢复系。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化(英文)

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5 (Rf1b5 ),装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978 bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化(英文)

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5′∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5′)的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5′∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

水稻恢复基因Rf3和Rf4聚合效应分析

为选育水稻野败型和夜公型细胞质雄性不育的较强恢复系和分析恢复基因Rf3和Rf4的聚合效应,采用5个携带不同供体恢复基因Rf3和4个携带不同供体恢复基因Rf4的单片段代换系两两杂交,配制了11个杂交组合。利用分子标记辅助选择从这11个杂交组合的F2和F3群体中筛选鉴定6个携带基因型Rf3Rf3/Rf4Rf4的双片段聚合系和5个携带Rf3(Rf4)的次级单片段代换系。结果表明,对于野败型不育细胞质,这些双片段聚合系具有不同的恢复性。其中,携带基因型Rf3-4Rf3-4/Rf4-4Rf4-4的DSPL04-01/23-10P1、DSPL04-01/23-10P2和DSPL04-01/23-10P3的恢复性最强,携带基因型Rf3-4Rf3-4/Rf4-2Rf4-2的DSPL11-01/14-10P和DSPL22-01/14-10P的恢复性最弱,携带基因型Rf3-4Rf3-4/Rf4-3Rf4-3的DSPL22-01/27-10P的恢复性居中。5个次级单片段代换系代换片段的总长度为133.9 cM,长度分布范围为24.1~28.5 cM,平均长度为26.8 cM。利用恢复性最强的DSPL04-01/23-10P1及其相应的单片段代换系分别与野败型不育系‘珍汕97A’和夜公型不育系‘Y华农A’杂交,通过考察F1杂种株的花粉育性,研究DSPL04-01/23-10P1中的恢复基因Rf3和Rf4的聚合效应。DSPL04-01/23-10P1较其相应的单片段代换系能够提高F1杂种株的花粉育性,但差异不显著。结论:本研究选育的双片段聚合系中所聚合的来自不同供体的恢复基因Rf3和Rf4之间没有互作效应。     

粳型优势生态型水稻Rf1a基因位点的检测

【目的】探明粳型优势生态型水稻中各品种(系)在Rf1a基因位点的差异,为粳型杂种优势群的利用提供基础数据。【方法】利用缺失设计引物Rfa-7F/Rfa-7R在粳稻恢复系中可扩增出957bp的片段,在保持系中可扩增出383bp的片段,对日本粳、台湾粳、韩国粳、巴西稻、美国粳、非洲IRAT粳、华北粳、非洲ITA粳、西北粳、东北粳、欧洲粳11个不同生态类型共60份材料进行PCR扩增检测。【结果】有14份材料是Rf1a/Rf1a基因类型,占所有材料的23%;日本粳、台湾粳、华北粳、西北粳和东北粳的所有材料是rf1a/rf1a基因类型,韩国粳、非洲ITA粳和欧洲粳有小部分材料是Rf1a/Rf1a基因类型,巴西粳、美国粳和非洲IRAT的大部分是Rf1a/Rf1a基因类型。【结论】粳型生态型水稻在Rf1a基因位点的差异,可以用引物Rfa-7F/Rfa-7R检测出不同基因类型,为粳型杂种优势群利用提供依据。     

水稻恢复系SSSLW23-19-06-06-11对WA-CMS的遗传模式分析

[目的]研究恢复系SSSL W23-07-06-01-09中的恢复基因Rf3和Rf4对于野败型不育细胞质的遗传模式。[方法]以野败型不育系博白A为母本,恢复系SSSLW23-07-06-01-09(Rf3Rf3/Rf4Rf4)为父本杂交,采用分子标记辅助选择和连续回交的方法构建BC3F2群体,从中选择携带基因型Rf3Rf3/Rf4Rf4、rf3rf3/Rf4Rf4的单株,考察其花粉和小穗育性。[结果]恢复系SSSLW23-07-06-01-09中的恢复基因对于WA型不育系博白A表现出质量-数量性状的遗传。在恢复系SSSLW23-07-06-01-09中,除主效恢复基因Rf3和Rf4外,微效基因或者修饰基因也表现出对于博白A的恢复性作用,且效应较大。[结论]为水稻杂种优势研究和利用提供理论依据。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cD-NA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5’（Rf1b5’）,装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

提高小麦T型雄性不育恢复基因Rf6雄配子的传递率

小伞山羊草 6U染色体与小麦 6A染色体易位系“2 114”(T6AL 6AS 6U)对T型雄性不育具有较高的恢复力 ,其恢复基因已被定名为Rf6。Rf6基因通过雌配子的传递率正常 ,而通过雄配子的传递率仅为 30 8% ,个中原因是外源的 6U染色体片段过长。柱穗山羊草杀配子染色体在小麦核背景中能够引起染色体断裂 ,产生缺失、易位等结构变异。鉴此 ,将 2 114与“中国春”小麦柱穗山羊草杀配子染色体二体添加系回交 ,从后代中选择到了可育株比例较高的株系。将这些株系与T型不育系测交 ,调查TCF2 群体育性分离表现 ,结果表明这些株系育性遗传表现不同于 2 114。“140 45”、“14136”两个F3 株系各含有 1对Rf6基因 ,其雄配子传递率正常 ,并且保持了 2 114原有的恢复力 ;而“140 2 0”、“140 44”和“140 88”3个F3 株系各含有两对Rf6基因 ,其中 140 2 0和 140 88两个F3 株系的第二对Rf6基因恢复力较低。产生变异的原因 ,可能与杀配子染色体引起外源染色体片段结构变异有关     

甘蓝型油菜Ogura胞质雄性不育系及恢复系聚类分析

[目的]对Ogura胞质雄性不育系及恢复系进行遗传差异分析,为生产上利用Ogura胞质不育系统选育强优势甘蓝型油菜杂交组合提供参考.[方法]利用分布于连锁群上的76对SSR标记分析79份甘蓝型油菜Ogura细胞质雄性不育系及恢复系材料间的差异并进行聚类分析.[结果]在76对SSR标记引物(每条连锁群4对SSR标记)中可筛选出38对标记;在79份材料中,38对SSR标记共扩增到123条清晰条带,扩增片段大小为100~400 bp;获得89个多态性位点,材料间遗传相似系数为0.52~0.99.聚类分析结果表明,在相似系数0.68处,可将79份材料分为A、B、C、D、E5个类群,92.4%的材料可归入A、B两类,其中72.1%的恢复系材料归入A类,72.8%的不育系材料归入B类.A类和B类又可在相似系数0.74处分别分为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7及B1、B2、B3、B411个亚群.[结论]SSR标记可用于甘蓝型油菜Ogura细胞质雄性不育系及恢复系的分类鉴定.     

Significant association of the novel Rf4-targeted SNP marker with the restorer for WA-CMS in different rice backgrounds and its utilization in molecular screening

In the rice cytoplasmic-genetic male sterility(CMS) system,the combination of a CMS line,maintainer line and restorer line carrying the restorer gene to restore fertility,is indispensable for the development of hybrids. However,the process of screening for the trait of fertility restoration is laborious and time-consuming. In the present study,we analyzed the nucleotide sequence of the Rf4 gene,which is the major locus controlling fertility restoration,to identify allele-specific variation. A single nucleotide polymorphism(SNP) A/C at +474 in the coding sequence(CDS) was found to be capable of strictly distinguishing groups of alleles Rf4(A) and rf4(C). Using KASP genotyping,this valuable SNP was converted to an allele-specific PCR marker. We evaluated and validated the marker among three-line parents with different backgrounds,and the results revealed a complete correlation between SNP alleles and the fertility restoration phenotype. Molecular screening was subsequently carried out for the presence of alleles of Rf4 and Rf3 among 328 diverse rice cultivars with worldwide distribution. The results demonstrate that this SNP marker could be the optimal choice for the molecular identification of potential restorers.     

金花薹萝卜雄性不育细胞质主要品质性状的胞质效应研究

[目的]研究萝卜雄性不育系细胞质的胞质效应。[方法]将不育系与恢复系配制成A系杂种,保持系与恢复系配制为B系杂种,测定其主要品质性状,根据它们之间的差异,确定其不育胞质效应。[结果]不育细胞质与可育细胞质在辣味素性状上存在着极显著的差异,细胞质效应来源于细胞质和核质间互作。金花薹不育细胞质除了纤维素和辣味素性状外,其余品质性状均表现为负效应,其中Vc表现为较强的负效应。不育细胞质的不利效应可以通过不育细胞质与恢复系之间的互作效应来降低。[结论]该研究为萝卜细胞质雄性不育系的正确评价和合理利用提供了一定的理论依据。     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。