猪乳中一组高分子量多态性蛋白质的同源性鉴定

 利用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析等方法从猪乳中分离纯化高分子量蛋白质B (HMWP-B)。 制备兔抗HMWP-B的多克隆抗体，免疫印迹结果表明，不同带型的HMWP之间存在免疫交叉反应，说明该组蛋白具有同源性，为其多态性假说提供了证据。     

泌乳反刍动物乳腺的氨基酸代谢

 乳腺是合成乳汁的主要场所。为了提高反刍动物饲料转化效率、泌乳量和乳蛋白产量，就有必要把乳腺氨基酸代谢作为研究的基础。本文从氨基酸供应、乳腺对氨基酸的摄取、乳腺氨基酸的代谢、能量供应对乳蛋白合成的调节等4方面，对泌乳反刍动物乳腺的氨基酸代谢进行综述，为进一步深入研究乳腺代谢，调控乳产量、乳蛋白含量提供依据。     

色氨酸对母猪乳成分及泌乳相关激素的影响

将20头健康长白×大约克母猪随机分成2组,即对照组和色氨酸(Trp)组.对照组饲喂基础日粮,Trp组饲喂基础日粮+0.12%Trp,于产前1、3 d及产后1、3、7、14、28 d采集母猪血液样品,检测血清中泌乳相关激素(雌激素、生长激素、催乳素,胰岛素,胰岛素样生长因子、表皮生长因子等)的含量,于产后1、3、7、14、28 d采集乳样,检测乳中乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物和非脂总固形物的含量,研究Trp对乳成分及泌乳相关激素分泌的影响.结果表明:在日粮中添加Trp除影响乳糖的含量外,对乳中其他的主要固形成分无显著影响;Trp组中的生长激素、催乳素和胰岛素等与泌乳及代谢相关激素的含量显著增加,其他激素和因子无显著变化.结果说明,在日粮中添加Trp对猪乳主要成分的稳定影响不明显,作为一种多功能的氨基酸,Trp可能通过影响乳糖及相关激素的合成调控母猪的泌乳能力.     

不同胎次放牧伊犁马产乳性能及乳品质相关性研究

【目的】研究不同胎次放牧伊犁马日产奶量及鲜马乳中营养成分的变化规律,探索自由放牧条件下伊犁马的泌乳性能,为开发利用马乳产品提供数据参考。【方法】利用SPSS18.0软件,分析不同胎次放牧伊犁马产奶量及营养成分的差异性,通过逐步回归分析建立回归方程。【结果】在第7胎次的营养品质较低(乳脂1.3%、乳蛋白1.66%、乳糖5.86%、总固形物9.3%),但产奶量较高(12.49L);第4胎次马奶的营养品质较高(乳脂1.35%、乳蛋白1.82%、乳糖6.13%、总固形物9.77%);建立了日产奶量与乳蛋白和总固形物与乳脂、乳蛋白、乳糖的回归模型,即Y产奶量=840.157-106.073X乳蛋白,Y总固形物=-0.147+1.187X乳糖+0.803X乳脂+0.864X乳蛋白。【结论】不同胎次放牧伊犁马的日产奶量及鲜马乳中乳糖、乳蛋白、乳脂和总固形物含量均呈显著或极显著差异性,产奶量与乳成分和各乳成分之间均存在一定的相关性。     

牛乳β-酪蛋白检测的ELISA方法

体外乳腺细胞培养是整体泌乳研究的有效补充,也在乳腺生物反应器的研究中发挥着重要作用.但乳腺细胞分离培养成功的标志不仅仅是细胞的形态特征及增殖特性,更重要的是细胞的生理功能及分化状态.β-酪蛋白为乳中所特有的蛋白质,其在乳中的含量仅次于α-S1酪蛋白居第二位,故可用这种蛋白做为乳腺细胞分化功能的指标.     

二花脸猪乳中乳糖和乳蛋白的动态变化及其与大约克猪的比较

通过两系列实验,分析了二花脸猪乳中乳糖和乳蛋白在泌乳早期阶段(1～21 d)的含量及其变化规律,并与大约克猪乳进行了比较.同时比较了二花脸和大约克猪乳在泌乳第1 d和第6～7 d的乳脂含量.结果表明,二花脸猪和大约克猪乳糖在初乳中很低,但随着泌乳天数增加其含量逐渐增加.二花脸猪乳中乳糖含量在整个泌乳早期阶段(1～21 d)低于大约克猪,其中在泌乳第1 d、第6～7 d和第8～10 d显著低于大约克猪(p＜0.05 或p＜0.01).二花脸猪和大约克猪乳蛋白在泌乳第1 d浓度最高,分娩1周内迅速下降 ,泌乳1周以后变化幅度不大,而且两品种猪差异不显著(p＞0.05).猪乳中乳蛋白与乳糖呈负相关,二花脸猪相关系数r=-0.703(p＜0.01),大约克猪相关系数r=-0.577 (p＜0.01).二花脸猪乳中乳脂含量在泌乳第1 d和第6～7 d显著高于大约克猪(p＜0.05).     

民猪PRLR基因PCR-SSCP多态性与产仔数关联分析

 【目的】 研究民猪促乳素受体基因PRLR的多态性与母猪产仔数的相关性。【方法】采用PCR-SSCP技术检测民猪PRLR基因多态性,最小二乘法分析其多态性对母猪产仔数影响的遗传效应。【结果】PRLR基因在民猪中存在多态性,B等位基因为优势等位基因;在PRLR-1座位,对于初产母猪,BB基因型母猪的TNB和NBA比AA基因型母猪分别多0.93头和0.78头（P＜0.05）;对于经产母猪,BB基因型母猪的TNB和NBA比AA基因型母猪分别多0.62头和0.74头（P＜0.05）。在PRLR-2座位,对于初产和经产母猪,3种基因型个体的TNB之间和NBA之间差异不显著（P＞0.05）。在民猪群中这两个座位均处于Hardy-Weinberg平衡状态。【结论】PRLR基因B等位基因对民猪产仔数性状有显著影响。     

热应激状态下泌乳奶牛通过激活GHIGF-I轴增强糖异生变化

【目的】选取分娩1周后的泌乳期荷斯坦奶牛6头,提前适应期1周后,正式饲喂从2013年6月29日至8月5日,总共35 d(5周),使泌乳奶牛处于热应激状态。进而检测泌乳奶牛乳产量及乳蛋白含量,血液中生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、葡萄糖以及肝脏中热休克蛋白70(HSP70)和糖异生作用的变化情况,拟从GH-IGF-I轴的角度阐明泌乳奶牛发生热应激时对糖异生作用及乳品质下降的机制。为进一步揭示奶牛热应激的发生机理及控制奶牛热应激的发生提供理论依据。【方法】分别统计第1—5周泌乳奶牛的产奶量及分析乳蛋白含量,并采集泌乳奶牛颈静脉血液和进行活体采取肝脏组织的方法,检测血液中葡萄糖和GH、IGF-I的含量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对奶牛肝脏组织中HSP70和糖异生的关键酶丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)进行检测。【结果】在35 d的饲喂过程中,日间平均气温在32℃以上的持续时间达25 d,且最高温度为38℃,高温持续时间大于72 h,即此气候条件下奶牛处于一个热应激状态。随着泌乳奶牛热应激程度的不断加深,从第1周到第5周产奶量和乳蛋白含量都有不同程度的下降。通过比较第5周和第1周泌乳奶牛肝脏中HSP70的表达,发现第5周HSP70的表达量极显著高于第1周。检测血液中GH、IGF-I以及葡萄糖的含量,发现在第5周的时候其含量均高于第1周且差异显著(P0.05);检测泌乳奶牛肝脏组织中PC和PEPCK的表达水平,发现第5周显著高于第1周(P0.05);通过检测第5周与第1周肝脏组织中GH和IGF-I受体的表达水平,发现GHR和IGFR同样上调,其中IGFR显著上调(P0.05)。【结论】随着泌乳奶牛热应激的程度的不断加深,血液中的葡萄糖含量显著升高,其可能是由于垂体分泌的GH刺激肝脏产生更多的IGF-I,即通过GHIGF-I轴上调肝脏糖异生途径关键酶的表达,使糖异生途径处于激活状态。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前体物被过多的用来进行糖异生作用,增加血液中葡萄糖含量,维持机体正常供能所致。     

治疗母猪产后不食的措施与方案

<正>产后不食是母猪哺乳期的常见疾病,易引发母猪泌乳量减少或无乳,不但严重影响到仔猪正常生长发育,而且母猪自身生长缓慢、抵抗力差、或变成僵猪、甚至最终导致母猪消瘦死亡或被淘汰,为养殖户造成较大的经济损失。发病原因营养不均衡母猪饲料中缺少蛋白质、矿物质及维生素等,会造成机体营养不良;缺钙或钙磷比例不当、日照不足或缺乏运动时,维生素D原不能转变成维生素D,使血钙浓度降低,胃肠蠕动缓慢,若病程长时,还会出现运动障碍;母猪产后大量泌乳,血液中葡萄糖、钙的浓度降低,中枢神经     

乳蛋白质组的研究进展

在概述蛋白质组研究方法的同时,对运用该技术研究乳蛋白质组的结果进行了阐述,以期探讨乳蛋白质在合成、降解和修饰过程中的规律,了解乳蛋白质组表达及表达量变化的调控机理,从而为探索乳腺组织分泌乳蛋白以及与此相关的生理和病理特点提供理论依据.此外,就蛋白质组学技术的引入对推进乳蛋白质广泛、深入的研究进行了展望.     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

普通烟草铁氧还蛋白I的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。     

家蚕类胰岛素相关肽结合蛋白2（BmIBP2） 的原核表达与组织特异性分析

【目的】从体外表达家蚕中新发现的1个免疫球蛋白超家族成员-类胰岛素相关肽结合蛋白2（BmIBP2）,并制备其多克隆抗体,为进一步深入研究BmIBP2的生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠的总cDNA为模板,利用普通PCR方法,扩增出BmIBP2基因的成熟肽序列;通过构建重组表达质粒pET-28a-BmIBP2对BmIBP2的成熟肽进行重组表达;制备多克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法研究BmIBP2蛋白的组织特异性。【结果】SDS-PAGE电泳分析表达产物发现,重组蛋白rBmIBP2主要以包涵体的形式表达,目的蛋白大小约为30 kD;以兔抗His-tag抗体为一抗进行Western blot检测,结果表明rBmIBP2具有良好的免疫反应性;用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的rBmIBP2,以纯化的rBmIBP2为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,Western blot结果显示家蚕的中肠组织匀浆液中有1条约28 kD大小的条带,大小与BmIBP2成熟肽的蛋白分子量基本一致,而脂肪体、血淋巴、丝腺、精巢及卵巢的组织匀浆液中没有检测到特异反应条带。【结论】成功地实现了BmIBP2在大肠杆菌中的表达和纯化,并获得其多克隆抗体,Western blot结果证明BmIBP2被正确表达,并明确了该蛋白只在家蚕中肠表达的组织特异性。     

单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的 原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。     

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。     

准噶尔双峰驼驼乳营养与功能成分与荷斯坦牛乳的差异比较分析

【目的】分析比较准噶尔双峰驼乳和荷斯坦牛乳的差异,为研究驼乳的营养价值和生物学功能提供科学基础。【方法】使用乳成分分析仪、电感耦合等离子体光度发射光谱法、气相色谱和ELISA检测乳的主要营养成分、理化特性、脂肪酸和主要生物活性物质含量。【结果】准噶尔双峰驼乳中乳蛋白、乳糖、钙、灰分、干物质显著高于荷斯坦牛乳(P<0.05)。乳密度也显著高于荷斯坦牛乳(P<0.05)。乳脂中花生酸、二十一碳酸、棕榈油酸和α-亚麻酸显著高于荷斯坦牛乳(P<0.05)。而准噶尔双峰驼乳的电导率、酸碱度、水分显著低于荷斯坦牛乳(P<0.05)。顺-8,11,14-二十碳三烯酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸显著低于荷斯坦牛乳(P<0.05)。但两乳中所检测的生物活性成分含量无显著差异(P> 0.05)。【结论】准噶尔双峰驼乳相较于荷斯坦牛乳存在诸多显著性差异。     

应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA检测方法的建立

 【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白（rMSG1）和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25%,其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用,并且与其它一些抗原无交叉反应;此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%,较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率。【结论】结果显示MSG1具有良好的抗原性,建立的ELISA方法具有较高的敏感性、特异性、符合性和可重复性,在临床检测中可以取得理想的效果。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。