林麝肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其kp05372基因的生物信息学分析

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行测定;以小鼠感染试验和半数致死量(LD50)测试该病原菌的致病性;用全基因组测序方法对病原菌基因组进行测序分析,并对发现的新基因编码产物进行生物信息学分析。【结果】经生理生化试验和16SrRNA序列分析发现,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌,命名为GPKP,其对小鼠致死的LD50为6.3×107CFU/mL。该菌基因组大小为4 879 707bp,包含5 490个开放阅读框,共注释到22组COG功能。kp05372基因编码产物由302个氨基酸组成,无信号肽,是一种不稳定的、在细胞内发挥生理作用的亲水性蛋白。【结论】分离的细菌为肺炎克雷伯氏菌,kp05372基因编码产物属于典型的LysR家族转录因子(LTTR)。     

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白 A 的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1 071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形...     

茉莉花JsMYB305转录因子的原核表达及蛋白纯化

[目的]获得茉莉花香气调控转录因子JsMYB305的重组蛋白,为深入研究JsMYB305调控茉莉萜类香气代谢的分子机理及筛选其他互作蛋白提供基础.[方法]通过酶切连接的方式,将JsMYB305的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1,转化BL21(DE3)表达菌株,通过IPTG诱导蛋白表达、GST亲和树脂分离纯化...     

桃果实PpARF1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】为了探讨转录因子ARF1(Auxin Response Factor)对桃果实发育调控的机制。【方法】以‘24号’桃果实为试验材料,构建桃ARF1基因的原核表达载体pET32a-PpARF1,转化到BL21(DE3)中诱导表达菌体蛋白,筛选出重组蛋白的最适表达条件,按照最适条件大量摇菌诱导表达蛋白,并进行重组蛋白的纯化,最后用纯化诱导后的重组蛋白制备多克隆抗体及WB检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测得到pET32a-PpARF1重组蛋白的位置大约在95.0kD,在37℃,转速250r/min,IPTG 0.10mmol/L,诱导4h,诱导出的蛋白表达量最大。免疫印迹试验显示所得抗血清能很好检测到目的蛋白。【结论】ARF转录因子参与生长素调控桃果实发育成熟的过程。     

肺炎克雷伯氏菌毒力因子及其基因组学研究进展

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科、克雷伯菌属,在人和动物肠道、呼吸道以及水、土壤、林产品和农产品中广泛存在,肺炎克雷伯氏菌作为一种机会致病菌,是目前公认的导致人和动物发病的重要革兰阴性菌。该菌可引起宿主感染肺炎、肝脓肿、脑膜炎、肠炎、子宫炎、乳腺炎及败血症。此外,随着测序技术的发展,全基因组序列分析已经广泛应用于探究肺炎克雷伯氏菌入侵以及抵抗宿主免疫系统引起致病的研究。对肺炎克雷伯氏菌毒力因子荚膜（Capsule）、脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）、菌毛（Fimbriae）、外膜蛋白（Outer membrane proteins）、铁载体（Siderophores）、尿囊素（Allantoin）代谢相关因子及其基因组学研究进展进行综述,并对肺炎克雷伯氏菌研究中的一些问题进行探讨。     

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的原核表达

本研究根据前期研究获得的鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,并在引物上下游引入BamHI和XhoI酶切位点,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-RaDtxR,对其进行IPTG诱导表达条件优化和表达目的蛋白的生物学活性鉴定。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,分子量约为51ku目的蛋白得到表达,并具有良好的生物学活性。本研究成功对鸭疫里默氏菌RaDtxR基因进行表达,为研究鸭疫里默氏菌RaDtxR蛋白生物学功能奠定基础。     

肠炎沙门菌调控基因hilD与hilA的体外表达规律研究

利用原核表达载体pCold I构建肠炎沙门菌转录调控蛋白HilD和HilA的重组表达菌,并采用Western-blot技术检测两者在体外培养条件下的表达规律。结果表明:成功构建了重组表达大肠埃希菌(E.coli)BL21(pCold I-hilD)和E.coli BL21(pCold I-hilA),经IPTG诱导得到了重组表达的rHis-HilD和rHis-HilA蛋白。将重组表达的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备蛋白的多克隆抗体,Western-blot进一步证明了抗体与蛋白可发生特异性反应。肠炎沙门菌C50041在LB培养条件下,HilD与HilA蛋白表现出不同的表达规律,从而为体外研究肠炎沙门菌SPI1与SPI2效应蛋白的表达和功能研究奠定了基础。     

RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其蛋白表达载体构建

本试验采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体.经过相关检验,TGA2转录因子连接到pMXB10载体内含肽(Intein)的N端,成功构建包含TGA2转录因子的pMXB10-TGA2蛋白表达载体.     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

生长分化因子15基因的克隆及重组原核表达载体的构建

为克隆人生长分化因子15基因,构建h GDF15基因的重组原核表达载体,为研究该基因的功能奠定实验基础,利用PCR技术克隆其基因序列,将其分别连接至p ET28a和p Cold I载体,构建重组p ET28a-h GDF15和p Cold I-h GDF15原核表达载体,并进行质粒PCR和双酶切验证以及测序验证。结果表明:重组载体构建成功,为进一步研究h GDF15蛋白的作用机制奠定基础。     

烟粉虱内共生菌传毒相关groEL基因dsRNA载体的构建及其在烟草中的表达

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种与植物病毒传毒相关的GroEL蛋白.以B型烟粉虱为研究对象,利用1对特异引物,对B型烟粉虱体内的groEL基因进行PCR扩增,选取502 bp groEL基因片段构建dsRNA,并将其连接植物表达载体pBIN19,将重组质粒电激转化农杆菌菌株LBA4404.采用农杆菌浸染转化本氏烟草,PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA;RT-PCR结果表明,502 bp的groEL基因片段在转基因植株中被转录.     

解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达

为挖掘新的拟除虫菊酯类农药降解基因，在大肠杆菌中实现异源高效表达，以本课题组前期筛选出的降解谱广泛、降解率较高的菌株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)为研究对象，克隆其菊酯类农药降解酶基因BioH,在大肠杆菌中表达。通过解鸟氨酸拉乌尔菌全序列进行基因组注释、蛋白注释和通路注释，和已有菊酯类农药降解基因序列比对，筛选出潜在的具有菊酯类农药降解功能的基因；以解鸟氨酸拉乌尔菌基因组DNA为模板，根据功能基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，回收目的片段后与pMD19-T载体连接，筛选阳性克隆并鉴定；酶切回收目的片段后和pET32a(+)表达载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，将验证正确的重组菌经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。结果表明：通过筛选得到BioH基因，该基因具有水解酶的作用，同时也具有其他菊酯类农药降解基因序列中存在的保守五肽motif-GXSXG,PCR扩增后得到大小为783 bp的条带，通过重组技术获得阳性克隆，PCR扩增、酶切和DNA测序进行验证，重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后获得约为...     

鼠疫杆菌YscF抗原基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌结构蛋白基因ApxIVA特异性片段的表达和纯化

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清8型分离株Hpn-405株基因组DNA为模板,PCR方法扩增ApxIVA特异性片段,PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建成重组表达质粒pET-ApxIVA3,转入到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG进行诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE检测结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为18 ku,与预期片段大小相符;将经过超声破碎的菌液离心取沉淀经尿素洗涤溶解后用镍金属螯合层析柱进行纯化。Western-blot分析证实,该融合蛋白具有免疫学活性。     

核桃油脂合成转录因子JrWRI1基因的克隆及生物信息学分析

为研究核桃果实油脂合成与积累的分子调控机理,以核桃果实种仁cDNA为模板克隆得到油脂合成关键转录因子JrWRI1基因,其cDNA序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸。通过对其结构特征、生物学特性进行分析,发现该基因编码蛋白属于AP2/ERF转录因子超级家族,具有特异的DNA结合序列,调节生物合成和代谢过程,定位于细胞核中,符合转录因子行使功能的特点。并构建了JrWRI1超表达重组载体,为进一步研究JrWRI1在核桃果实油脂合成与积累过程中的功能奠定基础,也为利用分子手段加快高油核桃新品种的选育提供参考。     

苜蓿中华根瘤菌Rm1021中gtrA基因的克隆、表达及纯化

对苜蓿中华根瘤菌中GntR家族转录因子基因gtrA进行了表达和纯化,以期进一步研究其功能.以苜蓿根瘤菌Rm1021的基因组为模板,PCR扩增出gtrA基因,并克隆到表达载体PET-28b(+)上.重组质粒经酶切和测序证实正确,然后转化大肠杆菌BL21.'SDS-PAGE显示经IPTG诱导后能得到和理论值大小一致的蛋白条带,通过进一步纯化得到gtrA的表达蛋白.     

mASR3基因超量表达载体的构建

ASR 是植物特异的亲水蛋白家族,近来发现它们在植物生长发育、成熟衰老以及非生物胁迫过程中起着 重要的作用。而mASR3 基因是从植物中发现的一种转录因子,为进一步研究该基因功能,将合成的mASR3 基因构 建入超表达载体pMD1 中,并通过农杆菌将此重组质粒转化入拟南芥,转入目的基因的拟南芥子叶为绿色,下胚轴 较长,并具有较长的主根,筛选得到的转基因植株,为该基因的进一步功能研究打下基础。     

绵羊肺炎支原体HSP70基因的克隆、表达及免疫原性分析

根据GenBank登录的MO HSP70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株HSP70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将HSP70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-HSP70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组HSP70具有良好的反应原性。重组HSP70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

基于酵母同源重组的转录因子活性分析

转录因子的转录激活验证是分析其转录活性的有效手段之一。黄曲霉菌bZIP5基因广泛参与该菌的生长发育,因此拟进行该转录因子的体外活性检测,以pGBKT7为骨架载体,采用酵母同源重组法构建载体,与体外重组酶法进行比较,并考察不同长度同源序列对酵母同源重组法构建载体的影响。结果表明：采用外源重组酶法构建载体pGBKT7-bZIP5,需要经过片段的体外重组连接、转化大肠杆菌,再提取质粒转化酵母AH109进行激活验证;而酵母同源重组法只需将线性化载体和片段一起转化酵母AH109,载体构建与激活验证同步完成,且21 ~ 30 bp不同长度的同源序列对酵母同源重组法构建载体没有影响,目的基因bZIP5均显示有自激活能力,故基于酵母同源重组的载体构建方法可行。该方法无需提供外源重组酶,为基于酵母的载体构建提供了便捷的途径。     

重组PEDV-S干酪乳杆菌的构建及其表达

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起猪的呕吐、腹泻及脱水。通过将其S1片段逆转录连接到干酪乳杆菌表面表达载体p LA上,使其表达蛋白,为进一步研究其特性及免疫原性奠定基础。采用TRIzol的方法从PEDV中提取RNA为模板,通过RT-PCR技术获得该病毒的S1片段,然后将该基因连接到载体p LA中并表达。重组菌经过培养表达之后,利用Western blot检测融合蛋白大小约为81 k Da;重组蛋白可被兔源的抗Pgs A血清和鼠源的抗PEDV血清所识别。表明重组干酪乳杆菌成功的表达了融合蛋白。