RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其植物表达载体构建

文章采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物;采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子,利用酶切连接方法,将该基因正向导入植物表达载体。经过相关检验,结果表明,TGA2转录因子正向插入中间载体的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,成功构建包含TGA2转录因子的p35ST-TGA2植物表达载体。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子的原核表达

为研究林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372的功能,采用PCR方法扩增林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372基因,连接T载体进行克隆,双酶切后连接表达载体pET-32(a),构建重组表达质粒,并转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,然后对其最佳表达时间、温度、IPTG浓度进行筛选,利用SDS-PAGE与Western Blot鉴定重组蛋白,得到约53.2 ku的融合蛋白,与预期大小一致。本研究成功构建kp05372基因表达载体,并筛选出最佳表达条件,为进一步研究该蛋白结构功能奠定了基础。     

绒山羊波形蛋白基因启动子的克隆及活性检测

以内蒙古阿尔巴斯白绒山羊基因组为模板，采用PCR方法克隆波形蛋白基因启动子，并与载体pEGFP-N1连接构建启动子荧光表达载体重组质粒，通过转染次级毛囊成纤维细胞，在荧光镜下鉴定启动子活性，应用生物软件对其序列进行信息学分析。结果表明：波形蛋白启动子区含有转录所必需的调控元件TATAbox、CAAT-box、GC-box等以及2个CPG岛；10个与启动子结合的转录因子；荧光镜下转染的成纤维细胞具有荧光蛋白表达，揭示波形蛋白启动子具有活性，它的激活可诱导下游的波形蛋白基因的转录和表达。     

环境光照改变马铃薯苯丙烷代谢途径相关酶和转录因子基因对低温胁迫的应答模式（英文）

[目的]通过实时荧光定量PCR分析不同环境温度和光照强度处理下,马铃薯苯丙烷类代谢途径关键酶基因,转录调节因子St R2R3-MYB和TGA基因表达情况。[方法]运用多因子及其互作逐步回归法建立光照强度、温度和处理时间影响基因表达的模式,逐步回归分析法研究St R2R3-MYB和TGA转录因子对苯丙烷类代谢途径关键酶基因的影响力。[结果 ]环境温度与St PAL、St DFR和St R2R3-MYB基因的表达量负相关,St TGA表达与温度正相关;环境光照强度与St CHS、St DFR和St R2R3-MYB表达正相关。环境光照强度和温度对St PAL和St DFR基因表达存在显著交互作用。[结论]环境光照强度影响马铃薯苯丙烷代谢途径关键酶St PAL和St DFR基因对温度的响应模式。马铃薯St R2R3-MYB转录调节因子对St CHS基因表达具有明显正向影响,而马铃薯St TGA转录调节因子对St DFR表达具有明显反向作用。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

烟草新驱动蛋白基因NtTKR原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

通过对烟草驱动蛋白家族新成员Nt Tkr尾部的酵母双杂交筛选,得到多个与Nt Tkr互作的候选蛋白。为进一步验证NtTkr与候选蛋白之间的相互作用,以p GBKT7-Nt Tkr质粒为模板,PCR扩增烟草NtTKR全长,将其克隆入原核表达载体pMXB10,重组质粒pMXB10-NtTkr-3582经生物公司测序,结果正确。将其转化为BL21(DE3),IPTG诱导其表达目的蛋白,经几丁质法纯化及SDS-PAGE检测,结果表明笔者得到了高纯度的目的蛋白。该试验为进一步运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了基础。     

环境光照改变马铃薯苯丙烷代谢途径相关酶和转录因子基因对低温胁迫的应答模式

[目的]通过实时荧光定量 PCR分析不同环境温度和光照强度处理下,马铃薯苯丙烷类代谢途径关键酶基因,转录调节因子StR2R3-MYB和TGA基因表达情况。[方法]运用多因子及其互作逐步回归法建立光照强度、温度和处理时间影响基因表达的模式,逐步回归分析法研究 StR2R3-MYB和 TGA转录因子对苯丙烷类代谢途径关键酶基因的影响力。[结果]环境温度与 StPAL、StDFR和 StR2R3-MYB基因的表达量负相关,StTGA表达与温度正相关;环境光照强度与 StCHS、StDFR和StR2R3-MYB表达正相关。环境光照强度和温度对 StPAL和 StDFR基因表达存在显著交互作用。[结论]环境光照强度影响马铃薯苯丙烷代谢途径关键酶 StPAL和 StDFR基因对温度的响应模式。马铃薯 StR2R3-MYB转录调节因子对 StCHS 基因表达具有明显正向影响,而马铃薯 StTGA转录调节因子对 StDFR表达具有明显反向作用。     

茉莉花JsMYB305转录因子的原核表达及蛋白纯化

[目的]获得茉莉花香气调控转录因子JsMYB305的重组蛋白,为深入研究JsMYB305调控茉莉萜类香气代谢的分子机理及筛选其他互作蛋白提供基础.[方法]通过酶切连接的方式,将JsMYB305的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1,转化BL21(DE3)表达菌株,通过IPTG诱导蛋白表达、GST亲和树脂分离纯化...     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

GPC3过表达载体的构建和表达检测

目的构建并检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）真核表达重组质粒。方法提取肾组织RNA进行逆转录,扩增GPC3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定并测序;将克隆成功的质粒转染至Huh7细胞,用荧光定量PCR和Western blot检测GPC3的表达水平。结果成功扩增GPC3编码区,并克隆至载体pcDNA3.1中;GPC3过表达载体转染至Huh7细胞后,荧光定量PCR和Western Blotting检测结果显示GPC3mRNA和蛋白表达水平均明显增加。结论成功构建GPC3过表达载体可用于后续研究。     

植物TGA转录因子研究进展

TGA基因家族是bZIP转录因子家族中十分重要的一组,其能够与靶基因启动子上的as-1区域相结合,激活或抑制下游靶标基因的转录,从而调控植株抗性或花器官发育。自烟草中首个TGA基因被鉴定以来,从拟南芥、水稻和苹果等多个物种中均有该家族基因被分离和鉴定出来。拟南芥基因组中共有10个TGA转录因子,依据其序列相似性可将其分为5组（Ⅰ组包含TGA1与TGA4;TGA2、TGA5与TGA6组成第Ⅱ组;TGA3与TGA7组成第Ⅲ组;TGA9和TGA10构成第Ⅳ组;PAN为第Ⅴ组）。其中Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ组成员广泛参与植株的抗病反应。酵母双杂交和pull-down等结果显示,TGA1-TGA7均可与水杨酸信号途径关键调节因子NPR1相互作用。EMSA结果表明,这种相互作用能够促进TGA对下游PR1启动子的结合并上调其表达,提高植株抗病性。但这3组基因在植物基础抗性与系统获得抗性中的作用有所不同：tga3突变体对病菌的基础抗性存在缺陷,但植株诱导抗性却并不受影响;TGA1与TGA4对基础抗性和系统抗性均有一定影响;TGA2、TGA5与TGA6之间存在功能冗余,仅tga2/5/6三突变体才表现出与npr1突变体类似的系统获得性抗性缺乏的表型。酵母双杂交筛选发现：Ⅱ组TGA能够与谷氧还蛋白GRX480相互作用并介导SA对JA途径标记基因的抑制作用,同时,该组蛋白还能够与GRAS家族蛋白SCL14相互作用,增强下游CYP81D11与GSTU7等解毒相关基因的表达,以一种不依赖于NPR1的信号途径提高植物对外源化学物质毒害的耐性。此外,tga1/4双突变体与nrt2.1/2.2双突变体的初生根和侧生根生长在低氮条件下较野生型显著下降,ChIP和酵母单杂交结果显示,TGA1能够与硝酸盐转运蛋白基因NRT2.1及NRT2.2的启动子相互结合,通过调节这两个基因的表达来调节植物的氮响应。而TGA3在镉长距离运输中发挥重要作用。Ⅳ与Ⅴ组成员在调控花器官发育中具有重要作用。tga9/10表现出与roxy1/2双突变体类似的花药发育缺陷的表型;PAN能够与NPR1类蛋白BOP1和BOP2相互作用,并且pan与bop1/2双突变体均可表现出5枚萼片的表型,暗示花发育与抗病可能具有类似的信号调节机制。在文章最后介绍了翻译后修饰对TGA功能的影响,并对TGA未来的研究方向进行了探讨,以期为该领域研究者提供参考。     

海岛棉DREB基因的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank上公布的棉花GhDREB1基因序列设计特异性引物,从海岛棉中克隆了一个与DREB类基因同源的cDNA序列,命名为XHDREB。序列分析表明,该cDNA序列长度为651 bp,推测含有216个氨基酸,分子量为24.6 kDa,等电点为9.46。同源性分析表明,它与GhDREB1的氨基酸序列同源性为85.19%。所编码蛋白具备DREB1转录因子的特征:含有58个氨基酸组成的AP2 DNA结合域以及两个DREB1/CBF特征氨基酸序列PKKRAGRKKFRETR和DSAWR。然后将XHDREB基因连接到pCAMBIA2300-35SOCS质粒上,构建了植物表达载体。     

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。     

梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

为深入分析 HaNAC20转录因子在梭梭抗逆机制中的作用,以梭梭［Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.) Bunge］ HaNAC20转录因子为对象,克隆其编码基因,对其基本理化性质、所属亚族及同源基因进行生物信息学分析,使用qRT-PCR方法对 HaNAC20在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下的表达量进行分析,构建表达载体,进行亚细胞定位及转录激活活性分析。结果表明：克隆得到1个编码区全长为822 bp的梭梭NAC转录因子家族基因,命名为 HaNAC20(登录号：KU845314),编码273个氨基酸。系统发育树显示 HaNAC20属于NAC家族中与非生物胁迫相关的SNAC亚族。核定位信号预测及亚细胞定位结果表明 HaNAC20定位于细胞核内。表达量分析结果显示：在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下, HaNAC20表达量均显著上调。转录激活分析结果显示该转录因子C端具有转录激活活性。表明 HaNAC20基因在梭梭响应非生物逆境胁迫、提高梭梭抗逆性中发挥重要作用。     

胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析

bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族,参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物,但是关于胡杨的bZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的cDNA,经分析,分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,获得CaMV35S:PebZIP26和CaMV35S:PebZIP33超表达株系和空载体对照株系。在含有150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇培养基上,PebZIP26和PebZIP33超表达株系根长均长于野生型,叶片嫩绿,无发黄萎蔫现象;另外,对盆土中的幼苗进行21 d的干旱处理和盐处理,超表达PebZIP26及PebZIP33株系耐旱耐盐性较强,表现为胁迫环境中植株营养生长较好,株高显著高于野生型(WT)及空载体对照株系,干旱复水后,植株存活率为61%及48%,显著高于WT的9%及空载体对照的12%。超表达PebZIP26及PebZIP33株系相比于WT和abf1及tga1(拟南芥同源基因ABF1及TGA1突变体)气孔关闭对外源ABA处理更加敏感,且对氧化胁迫的抗性较强。综上所述,胡杨PebZIP26和PebZIP33转录调节因子可能通过调控气孔开度和活性氧水平及根的生长正向调节植物抗旱耐盐性,进一步丰富了木本植物bZIP的基因功能认识,为遗传育种提供基因资源及理论依据。