拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

单基因及联合双基因转化拟南芥的抗寒性比较

将CBF3、AtGolS3基因通过中间载体连接到植物表达载体pVKH上,形成带有启动子和终止子的双价表达载体,转入拟南芥,以野生拟南芥为对照,与单独导入AtGloS3基因的转基因拟南芥对比,比较两种拟南芥植株抗寒性的差别。结果表明：单基因转拟南芥和联合双基因转化拟南芥的抗寒能力均比野生拟南芥强;而联合双基因转化拟南芥的抗寒能力又比单基因转拟南芥强。     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定,表明CBF3基因已整合到黄瓜基因组中。     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF 3基因,将其与CaMV 35 S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35 S-CBF 3.通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株.经PCR检测鉴定,表明CBF 3基因已整合到黄瓜基因组中.     

水杨酸诱导表达AtCBF1的转基因烟草研究

CBF是植物低温驯化过程中的关键性调控因子,过量表达CBF可显著提高转基因植物的非生物胁迫抗性。但是,组成型高表达CBF基因常导致转基因植株生长受阻。通过使用人工合成的水杨酸诱导型启动子,结果发现拟南芥CBF1基因在转基因烟草中受低浓度水杨酸诱导表达,且不影响烟草的生长发育。本研究结果说明,组合化学诱导型启动子和CBF基因,可以用于提高作物的抗环境胁迫的遗传改良中。     

高羊茅春化基因RNAi表达载体的构建

[目的]用RNAi干扰技术沉默高羊茅FaVRN1。[方法]将拟南芥内肌动蛋白含子（145bp）插入到表达载体pBI121已构建能形成发夹的中间载体。设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增高羊茅春化基因351bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体内含子两端,构建带发夹结构的RNA干扰表达载体。[结果]双酶切结果表明内含子（145bp）已成功连入表达载体。PCR和酶切验证证实目的基因（351bp）已连入中间表达载体。[结论]该研究为培育RNAi转基因开花抑制型高羊茅新品种奠定基础。     

冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示：克隆的CBF2基因长725bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99．8％;启动子Rd29A全长为956bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99．5％。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF2,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。     

双价抗寒基因CBF3/COR15A转化大白菜的初步研究

为探索拟南芥的冷诱导转录因子CBF3和抗寒基因COR15A在"黔白"系列大白菜的转化体系,以"黔白"系列大白菜3个优良自交系作为研究对象,分别用大白菜4d苗龄的带柄子叶、半子叶、下胚轴作为外植体,利用农杆菌介导的方法将同时含有CBF3和COR15A双价抗寒基因的表达载体转入大白菜,就影响大白菜再生和遗传转化的因素进行研究。通过抗生素筛选得到大白菜T0代转基因抗性植株36株,经PCR检测后获得转基因阳性植株6株。经抗寒性初步鉴定,转基因大白菜植株抗寒性超过对照。     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

2种启动子驱动下的VaCBF3基因植物表达载体构建

为了探索山葡萄CBF3基因(VaCBF3)对杨树的遗传转化的影响,及组成型启动子和诱导型启动子对转基因植株生长的影响,分别构建由2种类型启动子调控的植物表达载体.根据GenBank上公布的rd29A基因序列设计特异性引物,利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆rd29A基因启动子片段,利用限制性内切酶通过酶切、连接构建由组成型启动子35S和诱导型启动子rd29A基因启动子驱动的VaCBF3基因植物表达载体,利用冻融法完成重组质粒对根癌农杆菌LBA4404的转化.试验结果表明,所克隆的rd29A基因启动子片段序列分析表明该启动子片段长度为945bp,与GenBank中基因序列同源性达99％,具有DRE、ABRE、TATAbox和CAAT box4个完整的顺式作用元件,具有启动子功能.经过酶切、连接成功地将目的基因与载体质粒连接,并将重组质粒导入至根癌农杆菌LBA4404中,为下一步利用农杆菌介导法对杨树的遗传转化及研究2种启动子的启动效率奠定了一定的基础.     

油菜抗逆基因CBF1植物表达载体的构建及对拟南芥的转化

通过RT-PCR技术从油菜中克隆到抗逆相关基因CBF1,将其成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304,并通过农杆菌采用Floral dip法将重组表达载体转入拟南芥。经潮霉素抗性筛选和PCR检测,初步证明,油菜CBF1基因已经转入到拟南芥中。     

与逆境胁迫相关的rd29A启动子和CBF2基因的克隆及其表达载体构建

以拟南芥为材料,通过PCR扩增成功地克隆了逆境诱导型启动子rd29A和CBF2转录因子.序列分析表明,951 bp的rd29A序列包含完整的DRE、ABRE等4种保守顺式作用元件;651 bp的CBF2基因包含了完整的AP2 DNA结合域以及特异的氨基酸序列PKKPAGRKKFRETRHP和FADSAWR.同时,构建了由rd29A启动子调控的CBF2基因的植物表达载体.     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。     

靶向Annexin A3短发夹环RNA干扰载体的构建及鉴定

[目的]利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术构建和鉴定膜联蛋白A3(Annexin A3)的真核表达载体,为进一步研究Annexin A3在肝细胞中的功能奠定基础。[方法]人工合成3对shRNA序列,退火后定向克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo上,采用酶切和测序法鉴定。[结果]质粒酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。[结论]成功构建膜联蛋白A3靶向的真核表达载体。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

侧金盏花CBF转录激活因子基因片段的克隆

[目的]探索CBF转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板,根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得1个DNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]测序结果显示通过PCR扩增获得的基因片段长448 bp。在GenBank中检索,该序列与从拟南芥和其他作物中克隆的CBF同源基因序列同源性较低,说明是一个新的基因片段,初步认定该片段是侧金盏花CBF基因片段。[结论]该研究为进一步克隆侧金盏花CBF转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。