胡杨NAC转录因子PeNAC045基因的克隆及功能分析

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)分别转化野生型拟南芥(Col-0),进行亚细胞定位观察,结果显示PeNAC045-GFP融合蛋白定位于细胞核上,并由DAPI进行核染色标定。利用农杆菌花序侵染法将构建的表达载体pCAMBIA1301-PeNAC045转化野生型拟南芥和突变体(ataf2),通过PCR鉴定,获得过表达植株及ataf2/PeNAC045回补株系。对各株系进行NaCl胁迫处理,分析PeNAC045基因的生物学功能。在150 mmol/L NaCl胁迫下,相比于拟南芥突变体和野生型植株,拟南芥PeNAC045过表达株系的萌发率降低,根长变短。此外,拟南芥PeNAC045过表达株系的株高明显低于其他株系,其在苗期对盐胁迫的敏感性增加。研究结果表明,在盐胁迫下,PeNAC045作为转录调节因子,负调控胁迫相关基因的表达。      

不同处理对兰州百合子球根系生长的影响

为研究不同处理对兰州百合子球根系生长的影响,以兰州百合子球为试验材料,对不同处理下子球根数和根长进行了测定分析.结果表明:腐殖土/沙子(1∶1)是适宜百合子球基生根系发生的基质;栽培深度为子球高度2倍时能获得较多的基生根,栽培深度与地平齐时可获得较长的根系;NAA溶液处理能促进子球生根,合适的NAA溶液浓度在1∶1 000到1∶500之间;轻划子球鳞茎盘能够提高基生根系的发生,其处理结果极显著高于对照处理;兰州百合子球根数与根长在生长过程中都表现出快-慢-快-慢的规律.     

龙眼MEE70/MSI1基因DlMEE70-1a及其可变剪接体DlMEE70-1b的分离及其在体胚发生过程中的表达分析

MEE70/MSI1是拟南芥母性效应胚胎滞育基因,在植物胚胎发生过程中具有重要作用。采用RACE技术获得龙眼MEE70-1a(登录号KC492117)及其可变剪接体MEE70-1b(登录号KC492118)c DNA序列,克隆MSI1g DNA(登录号KC492126)序列。生物信息学分析预测Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b均为亲水不稳定的酸性蛋白,主要定位于过氧化物酶体和细胞核,各含有4和1个WD-repeat结构域。MEE70-1a和MEE70-1b在体细胞胚胎发生过程实时荧光定量PCR分析结果表明,Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b表达趋势以心形胚为界,除了Dl MEE70-1b的不完全胚型紧实结构(ICp EC)到球形胚(GE)阶段之间,都表现出先降后升的趋势;胚性愈伤组织(EC)时期两者表达量一致且最高;心形胚(HE)时期,两者表达量一致且最低,另Dl MEE70-1b在不完全胚性紧实结构(ICp EC)表达量与心形胚基本一致。这2个表达剂量是胚胎发生的重要保障,心形胚(HE)后,Dl MEE70-1a被再次激活转录促进胚胎正常发育。从Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b的理化性质、WD重复结构域数量、亚细胞定位以及表达量和趋势,可以推测Dl MEE70-1a需要Dl MEE70-1b的协同来调控龙眼胚胎发育。     

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P＜0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H₂O₂的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。      

文心兰OnCOBRA基因克隆及表达模式分析

以文心兰试管苗为材料,采用RT-PCR结合RACE法,克隆文心兰OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列。结果表明:COBRA全长为1 601 bp,开放阅读框(ORF)为1 386 bp,共编码461个氨基酸;OnCOBRA的DNA序列共2 949 bp,且含有6个外显子和5个内含子。生物信息学结果表明,OnCOBRA属于不稳定的疏水蛋白,具有信号肽、跨膜结构和CCVS保守区域,亚细胞定位于细胞膜中;与无油樟、玉米、籼稻、拟南芥等具有较高的同源性。系统进化树分析结果表明,文心兰OnCOBRA蛋白与玉米(ZmCOBRA)、无油樟(AtCOBRA)、籼稻(OsCOBRA)处于统一分枝,推测OnCOBRA基因是COBRA基因家族的成员。qPCR结果表明,OnCORBA为组成型表达,在成苗期表达量最高,在文心兰类原球茎时期表达量最低。     

荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD成员基因克隆及生物信息学分析

为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制,选择荔枝古树"宋荔"花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料,采用同源克隆和RACE方法,获得荔枝Fe-SOD的两个转录本和基因组序列,并对该基因组的内含子进行分析。克隆获得长1 285 bp含有完整开放阅读框的荔枝Fe-SOD核酸序列,其编码1个含有250个氨基酸的蛋白质,将该序列命名为LcFe-SOD7a。生物信息学分析结果表明:该蛋白为稳定的、亲水的、含跨膜结构域的偏酸性蛋白质,定位于微体(过氧化物酶体)和细胞质,具有多样的磷酸化位点。LcFe-SOD7a基因组序列长2 284 bp,含7个内含子,其中第4个内含子较长,达920 bp。同时还得到其中的1条内含子驻留型可变剪接基因,该可变剪接基因提前终止,仅编码207个氨基酸的蛋白质,将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b。     

胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析

bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族,参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物,但是关于胡杨的bZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的cDNA,经分析,分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,获得CaMV35S:PebZIP26和CaMV35S:PebZIP33超表达株系和空载体对照株系。在含有150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇培养基上,PebZIP26和PebZIP33超表达株系根长均长于野生型,叶片嫩绿,无发黄萎蔫现象;另外,对盆土中的幼苗进行21 d的干旱处理和盐处理,超表达PebZIP26及PebZIP33株系耐旱耐盐性较强,表现为胁迫环境中植株营养生长较好,株高显著高于野生型(WT)及空载体对照株系,干旱复水后,植株存活率为61%及48%,显著高于WT的9%及空载体对照的12%。超表达PebZIP26及PebZIP33株系相比于WT和abf1及tga1(拟南芥同源基因ABF1及TGA1突变体)气孔关闭对外源ABA处理更加敏感,且对氧化胁迫的抗性较强。综上所述,胡杨PebZIP26和PebZIP33转录调节因子可能通过调控气孔开度和活性氧水平及根的生长正向调节植物抗旱耐盐性,进一步丰富了木本植物bZIP的基因功能认识,为遗传育种提供基因资源及理论依据。