山羊Eda基因的克隆、序列分析及表达

【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。     

鸡IHH基因生物信息学及组织特异性表达分析

为分析鸡印度刺猬因子(Indian hedgehog，IHH)基因生物信息学及IHH基因在不同组织中特异性表达规律，选取体重相近、健康强健的6只鸡，借助生物信息学手段，对IHH基因结构、启动子和CpG岛进行分析，并通过实时荧光定量PCR检测IHH基因在鸡心、肝、脾、肺、肾、软骨、下丘脑、胸肌、十二指肠和胸腺组织中的特异性表达规律，同时对IHH蛋白进行相似性比较，并利用生物信息学分析IHH蛋白的理化和结构特性。结果表明，1)鸡IHH基因开放阅读框长度为1 227 bp，可编码408个氨基酸，具有3个外显子、4个核心启动子区和1个CpG岛。2)成功扩增IHH基因，IHH基因在鸡各组织中均有不同水平的mRNA表达，在软骨组织中相对表达量最高，在心、脾和胸腺组织中的表达量相对较低。3)鸡IHH蛋白在禽类中保守性较高，IHH蛋白大小为44.829 36 ku，属于偏碱性蛋白，具有1个跨膜端和1个信号肽；IHH蛋白二级结构中无规则卷曲的比例最高(44.12%)，只含有1个 HH-Signal功能域，内含大部分丝氨酸磷酸化位点，该蛋白还有14个苏氨酸磷酸化位点和5个酪氨酸磷酸化位点，鸡IHH蛋白存在1处N型糖基化位点和6处O型糖基化位点。综上，鸡IHH基因有3个外显子，有多个启动子区，在软骨组织中极显著高表达，鸡IHH蛋白是具有偏碱性、强热稳性和低亲水性的分泌型蛋白，IHH氨基酸序列在物种进化过程中比较保守，本研究为深入研究鸡IHH基因对软骨发育的调控作用提供依据。     

不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中chi-miR-107-3p及其相关基因的表达分析

为分析chi-miR-107-3p及相关基因在不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中的表达情况,本研究分别在毛囊休止期(4月)、兴盛前期(7月)、兴盛期(9月)和退行期(1月)采集了阿拉善型绒山羊(季节性长绒)和敏盖绒山羊(常年长绒)体侧皮肤组织,通过组织切片比较分析组织形态,实时荧光定量PCR法检测chi-miR-107-3p及ADCK5、DSBC1、ARSA、FMAP4、RHBDF2和ALDH3A2等6个相关基因表达量。结果表明:1)两种品系的绒山羊毛囊在形态特征上基本一致,但在同一时期生长规律不同;2)chi-miR-107-3p和RHBDF2基因在两种品系绒山羊皮肤毛囊不同发育周期的表达量呈相反趋势。在次级毛囊重建初期,chi-miR-107-3p表达量较高,而RHBDF2基因的表达量极低,随着次级毛囊重建逐步完成,chi-miR-107-3p表达量显著降低,RHBDF2基因的表达量逐渐增高。进入退行期,chi-miR-107-3p的表达量逐渐增高,而RHBDF2基因的表达量逐渐降低,休止期,chi-miR-107-3p的表达量达到最大值,此时RHBDF2基因的表达量最小,推测chi-miR-107-3p可能负向调控RHBDF2基因的表达;3)相关性分析表明,chi-miR-107-3p和RHBDF2基因表达水平均与皮肤毛囊性状显著相关(P<0.05),说明chi-miR-107-3p和RHBDF2基因均为两品系绒山羊皮肤毛囊生长发育的重要影响因子;4)ALDH3A2基因的表达量在皮肤毛囊休止期至兴盛期的过程中逐渐降低,由退行期至休止期的过程中逐渐增高。ALDH3A2基因与皮肤毛囊各性状均显著相关(P<0.05),表明高表达的ALDH3A2可能抑制两品系绒山羊毛囊的生长发育,是调控皮肤毛囊生长发育的重要影响因子,其他基因对绒山羊皮肤组织生长均无影响。本研究证实羊绒生长发育过程离不开miRNA及其相关基因参与调控,为进一步研究毛囊发育分子机理提供了参考,为实际生产中进行羊绒增产提供理论依据。     

羊绒生长期、休止期陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达

【目的】研究角蛋白相关蛋白9.2基因(KAP9.2)和Hoxc13基因在羊绒生长不同阶段皮肤组织中的表达量对产绒量的影响,为羊绒生长的调控机理研究奠定基础。【方法】以陕北白绒山羊为研究对象,以奶山羊作为对照,利用qRT-PCR方法,检测羊绒生长期和休止期高产、低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达量。【结果】 对于KAP9.2基因,在羊绒生长期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著低于低产绒量陕北白绒山羊（P＜0.01）,而在羊绒休止期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量却显著高于低产绒量陕北白绒山羊和奶山羊（P＜0.05）;对于Hoxc13基因,在羊绒休止期高产和低产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著高于奶山羊（P＜0.01）。高产和低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因在生长期、休止期平均相对表达量的变化趋势相似,均表现为生长期极显著低于休止期（P＜0.01）。【结论】KAP9.2对绒毛生长有抑制作用;Hoxc13对KAP9.2基因的表达可能具有调控作用。     

一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组测序与其遗传变异分析

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV5 1 168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%~97.0%,氨基酸相似性为31.8%~95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。     

黄颡鱼硒蛋白基因的克隆与分析

为探讨黄颡鱼硒蛋白selenow2a、selenop2和selenot2基因之间的关系，采用3′/5′ RACE PCR克隆得到3个基因的cDNA全长，分别为891、1 998和1 432 bp，其中ORF长度分别为288、828和600 bp，编码95、275和219个氨基酸。在线工具SECISerach3对3个基因的cDNA序列分析结果显示，它们都含有可以编码硒代半胱氨酸的终止密码子，以及在3′非编码区存在SECIS元件。通过氨基酸序列比对和系统发育树分析，发现selenow2a、selenop2和selenot2基因预测得到的氨基酸序列与斑马鱼（Danio rerio）氨基酸相似性分别为82.24%、66.19%和79.45%，而与斑点叉尾鮰（Ictalurus punetaus）的氨基酸相似性分别为94.74%、68.50%和90.95%，在发育树上则显示为树杈相接近。采用实时荧光定量PCR检测3个硒蛋白基因的mRNA在黄颡鱼心脏、肝脏、肌肉、脑、肠、脾脏、精巢和卵巢组织中的表达，结果显示其mRNA表达水平呈现组织特异性。表明3个基因拥有硒蛋白家族的特征，但在组织表达上具有特异性。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

绒山羊胎儿期毛囊发生发育关键circRNA的鉴定及功能预测分析

为探究调控绒山羊毛囊发生发育阶段关键circRNA及其功能,基于课题组前期得到的内蒙古绒山羊胎儿期(45、55、65和75 d)皮肤组织circRNA表达谱以及各比对组中差异表达circRNA的基础,根据不同时期毛囊形态发生发育情况筛选了毛囊发生发育相关的circRNA,利用生物信息学分析毛囊发生发育关键circRNA...     

骨形态发生蛋白2（BMP2）基因在内蒙古绒山羊不同时期皮肤毛囊中的表达

 【目的】研究内蒙古绒山羊毛囊发育兴盛期和休止期BMP2基因在皮肤毛囊中的表达情况。【方法】功能分类基因芯片以及原位杂交技术。【结果】原位杂交结果表明,该基因在休止期毛囊毛干周围高表达,在兴盛期不表达;基因芯片结果显示,同兴盛期相比,休止期BMP2基因在皮肤中表达上调24.65倍。【结论】BMP2基因抑制内蒙古绒山羊皮肤毛囊发育,与维持皮肤毛囊处于休止期有关;该基因主要在皮肤毛囊的毛干周围发挥作用,从而达到维持皮肤毛囊发育处于休止期的作用。     

褪黑激素对Bcl-2和Bax基因在绒山羊皮肤中表达的影响

【目的】研究褪黑激素对内蒙古绒山羊皮肤Bcl-2和Bax基因表达的影响,探讨Bcl-2和Bax基因以及褪黑激素与绒山羊绒毛生长和凋亡的关系。【方法】选用8只性别、体重、年龄一致的内蒙古绒山羊母羊,随机分为埋植组和对照组,提取皮肤总RNA,对Bcl-2和Bax基因mRNA表达进行相对定量分析。【结果】①Bcl-2和Bax基因在内蒙古绒山羊皮肤细胞中相对表达量比值（Bcl-2/Bax）的增减与绒山羊一年中绒毛生长、退行以及休止时间特点基本吻合;②褪黑激素对Bcl-2基因在内蒙古绒山羊皮肤中的表达无显著影响（P＞0.05）,但显著上调了Bax基因在各月份的表达（P＜0.01）。【结论】褪黑激素显著下调了Bcl-2和Bax基因在内蒙古绒山羊皮肤细胞中相对表达量的比值（Bcl-2/Bax）,可促进细胞凋亡,加快机体新陈代谢。     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊角蛋白5在毛囊生长周期中的表达

为探明角蛋白5(keratin 5,K5)在毛囊生长周期中的作用机制,采用免疫组化方法检测角蛋白5(K5)在内蒙古绒山羊毛囊生长周期中的表达情况。结果表明,在毛囊生长初期(6月),K5低表达于毛囊内根鞘和外根鞘;在毛囊生长旺盛期(10月),K5在内外根鞘同时表达,并在外根鞘表达量较高;在退行期(1月),K5在外根鞘低表达;在休止期(3月),K5基本不表达。由于K5的表达与绒毛生长周期发育规律一致,推测K5对绒毛的周期性生长可能是通过对内根鞘和外根鞘发挥作用的。     

内蒙古绒山羊毛囊形态发生规律

以胚胎龄40~110 d内蒙古二郎山绒山羊胚胎体侧部皮肤为材料,通过石蜡切片、HE染色,研究绒山羊胚胎毛囊形态发生规律。结果显示,内蒙古绒山羊胚胎皮肤初级毛囊形态发生经历毛基板前期、毛基板期、毛芽期、毛钉期和毛囊期5个时期,这5个时期又可根据其形态结构的差异划分为不同的亚期,内蒙古绒山羊胚胎皮肤初级毛囊形态发生与汗腺的发生相伴随;内蒙古绒山羊皮肤初级毛囊形态发生是分批进行的。在胚胎龄40~110 d内蒙古绒山羊胚胎体侧部皮肤未观察到次级毛囊的发生。     

中国绒山羊的毛囊结构特性与发育机制

绒山羊业是中国畜牧业的重要组成部分,其皮肤次级毛囊所产的山羊绒是毛纺工业中最优质的天然纤维原料,也是中国国际贸易份额比重最大的畜产品.绒山羊皮肤次级毛囊是山羊绒纤维的“发源地”,因而绒山羊皮肤毛囊的结构特点、遗传特性、发生发育与周期性变化及调控因素,是了解绒山羊种质特性的基础,也是绒山羊选育研究的基础.笔者在查阅国内外对绒山羊皮肤毛囊研究文献的基础上,结合多年的研究结果,综述了中国绒山羊毛囊性状与发育调控研究的现状与进展,以期为指导绒山羊育种提供理论基础.     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊毛囊结构及形态发生过程研究

 【目的】了解绒山羊毛囊的组织结构及毛囊形态发生变化过程，为研究绒山羊绒毛发育的分子调控机理奠定组织学基础。【方法】制作内蒙古阿尔巴斯绒山羊胚胎皮肤组织切片，显微镜下观察照相。【结果】绒山羊的毛囊结构同其它动物一样，由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干几部分组成。在胎龄55～65 d毛囊开始发生形成毛芽；胎龄135 d，大多数初级毛囊和一部分次级毛囊发育基本成熟；次级毛囊是初级毛囊的一个分支。【结论】了解了绒山羊毛囊的结构组成及毛囊从发生到发育成熟的整个形态变化过程，为相关领域研究者提供借鉴。     

内蒙古白绒山羊蛋白激酶B/AKT基因的克隆及表达模式分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因 cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长 1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊（NM_001161857.1）同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域。Psite分析表明,含有1个cAMP-/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、10个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个蛋白激酶ATP结合区信号和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区域。PSORT程序预测其定位于细胞质中。AKT基因mRNA丰度在睾丸、脑和肾中较高,在脾、肝、肺及乳腺组织中相对低。绒山羊胎儿成纤维细胞中抑制mTOR活性,AKT表达量降低。【结论】内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA全长ORF的核苷酸序列与绵羊的AKT基因具有很高的同源性,AKT基因在脾、睾丸、脑、肝、肺、乳腺及肾组织中均有表达,其AKT的表达受mTOR信号通路的调控。