内蒙古白绒山羊LDH-A基因cDNA的克隆与特性分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊乳酸脱氢酶A（LDH-A）基因并分析其基本表达模式。【方法】采用RT-PCR和3′ RACE技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法进行组织表达检测。【结果】获得了内蒙古白绒山羊LDH-A基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 649 bp,包含一个996 bp的ORF和642 bp 的3′ UTR。SMART分析表明ORF编码的蛋白质具有Ldh_1_N domain和Ldh_1_C domain,Psite分析表明有L-乳酸脱氢酶活性位点,PSORT程序分析将其定位于细胞质中。LDH-A基因在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。【结论】内蒙古白绒山羊LDH-A基因编码的蛋白具有典型的乳酸脱氢酶结构,cDNA核苷酸序列与牛的LDH-A基因（NM_174099.2）具有较高的同源性。在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

山羊MC4R基因cDNA的克隆和序列分析及组织表达研究

【目的】克隆山羊黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor 4)基因(MC4R)的cDNA编码区和部分5′、3′非编码区序列,分析其在不同组织中的表达规律。【方法】以安徽白山羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大肠、小肠、瘤胃、子宫等组织为材料,运用同源序列克隆技术并结合RT-PCR方法,对其MC4R基因cDNA进行克隆,并对其进行了组织表达和生物信息学分析。【结果】克隆得到了山羊MC4R基因全长,包含999bp的完整CDS编码区,共编码332个氨基酸。山羊MC4R基因与绵羊同源性最高(96.9%),其次为牛(93.5%)。山羊MC4R基因在心脏、肝脏等10种组织中均有表达,其中在肾脏组织中的表达量最高,大肠和小肠组织中的表达量最低。MC4R蛋白的相对分子质量为36 444.0u,等电点(PI)为7.52,分子式为C1 664H2 619N413O454S24,含有7个跨膜结构、5个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和1个特异蛋白激酶的磷酸化位点。MC4R空间结构包括7个α螺旋和5个β折叠。【结论】MC4R基因在动物进化中比较保守,并具有相似的生物学功能。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

编码杧果丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用BlastX比对发现,有6个阳性克隆是抗病基因同源序列,并命名为PK1~PK6,GenBank注册序列号为AY693369~AY693371和AY776277~AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ~Ⅸ,而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现,6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之,6个克隆不仅是抗病基因同源序列而且是可能的受体样蛋白激酶基因同源序列。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

编码杜果丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物，PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用Blast X比对发现，有6个阳性克隆是抗病基因同源序列，并命名为PK1～PK6，GenBank注册序列号为AY693369-AY693371和AY776277-AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ～Ⅸ，而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现，6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之，6个克隆不仅是抗病基因同源序列而且是可能的受体样蛋白激酶基因同源序列。     

小菜蛾p38 MAPK基因的克隆与生物信息学分析

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是一种危害十字花科植物的世界性害虫,研究其基因功能为寻找新的小菜蛾防治方法具有重要意义。本研究克隆了小菜蛾p38 MAPK基因的开放阅读框(ORF),并根据其DNA序列推导出了蛋白一级结构,发现该基因编码一个含有349个氨基酸残基的蛋白。通过SMART网站分析发现该蛋白在第20~304位氨基酸残基区域存在着一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,说明它是一个潜在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Blast比对发现Pxp38基因与家蚕Bmp38基因、酿酒酵母ScHOG1基因、人类Homo sapiens p38基因在蛋白一级结构上的相似性分别是91.7%、51.6%和78.6%,说明p38 MAPK基因在进化上具有较高的保守性。     

piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac（PB）转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT（58.35%）碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC（57.8%）。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。     

大足黑山羊卵泡抑素cDNA的克隆、序列分析及组织表达

 【目的】旨在克隆大足黑山羊卵泡抑素（follistatin）的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异。【方法】采用RT-PCR方法从大足黑山羊卵巢组织总RNA中克隆出follistatin的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用real-time PCR技术检测follistatin基因在不同组织中的表达。【结果】序列分析表明,大足黑山羊follistatin的cDNA序列全长为1 217 bp,包括该基因完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）1 035 bp,编码344个氨基酸。与牛的核苷酸序列比对同源性高达98%。real-time PCR结果表明,follistatin基因能在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢和垂体中检测出来,在肾脏中表达量相对较高,在垂体中表达量较低。肾脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;心脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;其余各组织间follistatin mRNA含量差异均不显著（P＞0.05）。【结论】成功克隆出大足黑山羊follistatin基因cDNA序列,该基因在肾脏中的表达高于其它组织。     

新疆南疆绒山羊与新疆山羊主要经济性状的差异分析

[目的]对比分析新疆南疆绒山羊和新疆山羊在抓绒后体重、产绒量、绒层厚度、绒纤维直径四项指标上的差异,进一步阐明两个品种所具有的品种优势,为绒山羊育种工作提供一定理论依据.[方法]实验随机选取264只新疆南疆绒山羊成年母羊和158只新疆山羊成年母羊,分别测定其抓绒后体重、产绒量、绒层厚度、绒纤维直径四项指标,并对其主要绒性状进行相关分析.[结果]新疆南疆绒山羊抓绒后体重、产绒量、绒层厚度均极显著高于新疆山羊(P＜0.01),绒纤维直径上,两品种差异不显著(P＞0.05).两品种绒纤维直径与绒层厚度、产绒量呈正相关关系,且相关关系显著(P＜0.05).[结论]南疆绒山羊品种优势明显,具有较高的推广价值;利用各品种其绒纤维直径与绒层厚度、产绒量的相关关系,一定水平可以用于绒山羊绒纤维直径的预测.     

Immune BlotAnalysis on Expression of the Mammalian Target of Rapamycin in Goat Fetal Fibroblasts with Recombinant Polyclonal Antibody

To detect the mammalian target of rapamycin (mTOR) expressed in Cashmere goat fetal fibroblasts (GFb), mTOR gene was cloned from Inner Mongolia Cashmere goat (Capra hircus) and expressed in Escherichia coli followed by immunizing mice with the purified recombinant protein as an immunogen to produce the anti-goat mTOR recombinant polyclonal antibody. Antiserum was collected from the immunized mice after the fifth immunization and its titer was determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the recombinant polyclonal antibody had a titer 1:200 000 and could react with the mTOR expressed in GFb cells with a specific and sensitive affinity. Western blot showed that mTOR expression and phospho-mTOR (Ser 2448) activity were inhibited when GFb cells were treated with CCI-779, an mTOR specific inhibitor.     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

褪黑激素对PDGFA基因在绒山羊皮肤毛囊中表达模式的影响

【目的】探讨血小板衍生生长因子A（platelet-derived growth factor A,PDGFA）在内蒙古阿尔巴斯绒山羊皮肤毛囊上的表达规律和褪黑激素对其的影响。【方法】选择体重和产绒量相当的阿尔巴斯绒山羊成年母羊,分为4组,即从不埋植的对照组和3组不同时间埋植褪黑激素的试验组。试验组在埋植期间每隔一个月按照2 mg?kg-1 BW的剂量在绒山羊耳后皮下埋植褪黑激素。采集12个月（从2009年8月至2010年7月）的受试羊体侧部皮肤样品,用定量逆转录PCR （qRT-PCR）检测皮肤中PDGFA基因的表达量。【结果】各组间PDGFA基因的表达模式不同。对照组在11月时其表达量为全年最低,在12月,随着毛囊周期性生长缓慢进入退行期,其PDGFA基因的表达量也缓慢上升,并在休止期（1-4月）高度表达。而开始埋植褪黑激素后,仅第二年埋植组在翌年1月时表达量显著提高（P<0.05）;在2月与连续两年埋植组一样,随着绒毛开始脱落,PDGFA基因的表达量也有下降趋势;到5月,其表达量显著低于1月（P<0.05）,此时新一轮的绒毛已长出体表。停止埋植褪黑激素后,仅第一年埋植组翌年PDGFA基因的表达模式和毛囊生长周期与对照组基本一致。【结论】绒山羊皮肤组织当中PDGFA基因在毛囊生长期低表达,退行期和休止期高表达。埋植褪黑激素可缩短毛囊生长周期。PDGFA基因是一个控制毛囊从兴盛期向退行期和休止期转化的因子。     

褪黑激素对Bcl-2和Bax基因在绒山羊皮肤中表达的影响

【目的】研究褪黑激素对内蒙古绒山羊皮肤Bcl-2和Bax基因表达的影响,探讨Bcl-2和Bax基因以及褪黑激素与绒山羊绒毛生长和凋亡的关系。【方法】选用8只性别、体重、年龄一致的内蒙古绒山羊母羊,随机分为埋植组和对照组,提取皮肤总RNA,对Bcl-2和Bax基因mRNA表达进行相对定量分析。【结果】①Bcl-2和Bax基因在内蒙古绒山羊皮肤细胞中相对表达量比值（Bcl-2/Bax）的增减与绒山羊一年中绒毛生长、退行以及休止时间特点基本吻合;②褪黑激素对Bcl-2基因在内蒙古绒山羊皮肤中的表达无显著影响（P＞0.05）,但显著上调了Bax基因在各月份的表达（P＜0.01）。【结论】褪黑激素显著下调了Bcl-2和Bax基因在内蒙古绒山羊皮肤细胞中相对表达量的比值（Bcl-2/Bax）,可促进细胞凋亡,加快机体新陈代谢。     

陕北白绒山羊Lhx2毛囊表达载体构建及转染成纤维细胞的研究

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.