番鸭cDNA-AFLP体系的建立

以番鸭脑垂体为材料,用Trizol法提取总RNA,用Superscipt Ⅱ-RT合成第一链cDNA,RNase H和DNA Polymerase合成第二链cDNA,最后用EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ分步酶切cDNA各2h,经T4连接酶合成双链cDNA,预扩增反应后产物稀释40倍进行选择性扩增反应.经1％琼脂糖电泳及6％变...     

油松雌性不育系(28号无性系)的RAPD分析

辽宁兴城油松种子园中的28号无性系是雌性不育变异体.为了探索不育原因,揭示与育性相关的分子机制,该实验运用RAPD技术对28号雌性不育系及部分可育系进行分析,目的在于寻找与28号不育系遗传背景最相近的可育系,为进一步研究提供选材依据.实验结果表明,59个10碱基的随机引物共扩增出236个条带,其中具有多态性的条带有42个,占17.8 %,证明供试油松无性系间遗传变异性较小.用NTSYS2.0软件包进行结果分析,发现可育系中15号无性系与28号不育系遗传距离较近,此组材料可用作研究油松雌性不育分子机制的对比材料.用S37号引物从28号雌性不育系基因组扩增出一条分子量为750 bp的特异DNA片段.     

玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

以玉米骨干自交系478为试验材料,从各生长时期的叶片中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米叶片全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.54×107转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.03×106pfu/mL,重组率为95%。     

油松雌性不育性与胚珠发育过程中物质代谢关系的初探

该文在不育系雌配子体休眠解除期(Ⅰ)、游离核停止分裂期(Ⅱ)、败育期(Ⅲ)时,取油松可育系和不育系胚珠、珠鳞及由胚珠诱导的悬浮细胞为材料,比较了它们在重量(w)、可溶性糖(ss)、游离氨基酸(aa)和可溶性蛋白质(sp)含量上的变化.结果表明:不育系连体胚珠在Ⅰ期,ss、aa和sp低于可育系;Ⅱ期,ss、aa高于可育系,sp低于可育系;到Ⅲ期,只有aa高于可育系.不育系连体胚珠在3个发育时期,w和aa呈上升趋势,ss和 sp分别呈下降趋势.而可育系连体胚珠的鲜重(fw)、sp呈上升趋势,ss、aa呈下降趋势.在相同营养物质和植物激素条件下,相应连体胚珠发育时期离体培养的两系胚珠和悬浮细胞在fw、ss、aa、sp含量的变化上呈现与可育系连体胚珠相似的趋势,但不育系的fw、sp均高于可育系,ss、aa均低于可育系.不同育性和3个发育时期的连体及离体胚珠的fw、ss、aa、sp差异极显著,不同育性悬浮培养细胞的ss、aa、sp差异极显著.珠鳞的发育与胚珠的发育表现出相关性.我们认为,不育系胚珠内营养物质和植物激素在含量上的不足或配比上的不协调,使胚珠在 ss、aa和sp代谢上出现紊乱,可能导致了不育系胚珠的败育.      

油松雌性不育系(28号无性系)的RAPD分析

辽宁兴城油松种子园中的 2 8号无性系是雌性不育变异体 .为了探索不育原因 ,揭示与育性相关的分子机制 ,该实验运用RAPD技术对 2 8号雌性不育系及部分可育系进行分析 ,目的在于寻找与 2 8号不育系遗传背景最相近的可育系 ,为进一步研究提供选材依据 .实验结果表明 ,5 9个 10碱基的随机引物共扩增出 2 36个条带 ,其中具有多态性的条带有 4 2个 ,占 17 8% ,证明供试油松无性系间遗传变异性较小 .用NTSYS2 0软件包进行结果分析 ,发现可育系中15号无性系与 2 8号不育系遗传距离较近 ,此组材料可用作研究油松雌性不育分子机制的对比材料 .用S37号引物从2 8号雌性不育系基因组扩增出一条分子量为 75 0bp的特异DNA片段 .     

异子蓬异型种子萌发基因差显的cDNA AFLP技术体系优化

以异子蓬种子为材料,建立并优化其萌发过程中基因表达差显的cDNA-AFLP技术体系。分别以总RNA和mRNA反转录的双链cDNA为模板,对25μL PCR扩增体系中的退火温度、引物量、DNA聚合酶种类及电泳条件进行优化。结果显示,以分离的mRNA为模板可以反转录得到品质较好的双链cDNA;PCR扩增选择较高退火温度(第1轮为56℃,第2轮为65～56℃)、引物量为1μL(10μmol/L)、使用高效PremixLA Taq Hot Start DNA聚合酶、在约800V电压下进行60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可得到条带清晰、多态性好的cDNA-AFLP结果。     

适于cDNA-AFLP的黄瓜幼叶总RNA快速高效提取方法

为了快速高效地提取黄瓜幼叶总RNA,满足于cDNA-AFLP实验的要求。对Trizol试剂提取总RNA的方法进行了改进,所提RNA经琼脂糖电泳检测,其28S、18S、5S 3条带清晰,完整性好,每0.1g幼叶可获得RNA 100~150μg,产率高;经反转录、双链cDNA合成和cDNA-AFLP检测,证实提取的RNA能满足反转录和cDNA-AFLP对RNA质量和数量的要求。     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

利用SMART技术构建鸡法氏囊全长cDNA表达文库

为构建鸡法氏囊组织互补DNA(cDNA)文库,从3周龄鸡法氏囊组织提取总RNA,用偶联oligo(dT)磁珠纯化mRNA,用SMART(Switching methanism at 5'end of RNA transcrip)技术合成cDNA第1链,用LD-PCR方法扩增双链cDNA.经Sfi Ⅰ酶切消化后,用CHROMA SPIN-400柱去除400 bp以下小片段,获得的双链cDNA与同样酶切的pMyr表达载体连接,电转化大肠杆菌获得cDNA文库.初始文库容量为2.8×106cfu,重组子比例为100%,插入片段的大小平均为1.2 kb.扩增后文库容量为8×1011cfu·mL-1.所建文库为鸡传染性法氏囊病毒受体基因克隆及功能研究奠定基础.     

小鼠胚泡着床期LongSAGE文库中双标签的制备研究

研究探讨小鼠胚胎着床期LongSAGE文库构建过程中总RNA提取、cDNA合成及双标签(D itags)制备方法,优化PCR扩增中双标签PCR的最佳模板稀释度及扩增循环次数。     

紫外线辐射的葡萄幼果cDNA文库的构建

以紫外线辐射的葡萄幼果为材料提取总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库,初始文库含有1.5×106个独立的单克隆,扩增后滴度达到1.2×108pfu.mL-1.随机挑取噬菌斑进行PCR检测,发现重组率在92.9%以上.     

普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较

为了比较普通PCR和降落PCR( TD - PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段.结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepcidin.测序结果显示:叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因...     

一种有效的可口革囊星虫体壁总RNA提取方法

[目的]为从可口革囊星虫体壁中提取高质量的RNA,以便深入开展分子生物学研究。[方法]采用Trizol法、改良Trizol法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法3种方法提取可口革囊星虫体壁中总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取总RNA的效果。[结果]改良Trizol法提取的总RNA经电泳后能看到清晰完整的28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA条带,无拖尾现象；而Trizol法和CTAB法提取的总RNA电泳条带完整性较差,缺少28S rRNA。[结论]传统的Trizol法和CTAB法不适用于可口革囊星虫体壁总RNA的提取；改良Trizol法提取的总RNA电泳条带清晰、完整性好,质量符合cDNA合成、RT-PCR扩增等后续实验要求,适用于提取可口革囊星虫体壁总RNA。     

一种自制的RNA分离试剂及其在鱼组织总RNA提取中的应用

【目的】尝试自制一种价格低廉的RNA分离试剂,并检验其应用效果。【方法】以商业化的TRizol Reagent为对照,使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA,采用分光光度计法、变性琼脂糖凝胶电泳法和RT-PCR检测其品质,并用提取的总RNA合成草鱼皮肤cDNA。同时使用自制RNA分离试剂提取斑马鱼总RNA,通过RT-PCR进行E2F5基因全长（1 092 bp）的克隆,构建其真核和酵母表达载体并测序。【结果】使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA的品质与用TRizol Reagent提取的总RNA品质相当,用之成功地合成了草鱼皮肤cDNA。使用自制RNA分离试剂提取得到了更高品质的斑马鱼总RNA,用之成功地克隆了斑马鱼E2F5基因,构建了其真核表达载体pcDNA3.1-flag-Zf E2F5和酵母表达载体pGAD GH-Zf E2F5。【结论】自制RNA分离试剂能够用于鱼类组织总RNA的提取,提取的总RNA能满足后续cDNA合成及RT-PCR克隆特定基因的需要。     

PNRSV RT-PCR检测体系的建立与应用

以指示植物GF305和田间果树为试材,建立并优化了特异性强、灵敏度高、成本低的李属坏死环斑病毒(PNRSV)RT-PCR检测体系,使用该优化体系对樱桃树、桃树和杏树中携带PNRSV的情况进行了调查。结果表明,被检材料的李属坏死环斑病毒(PNRSV)感染率均较高,但程度不同。     

鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析

以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。     

不同方法提取狗脊蕨叶片总RNA的比较分析

[目的]为构建狗脊蕨叶cDNA文库,保存珍贵基因资源,克隆和研究与有效成分合成相关的基因等提供技术参考。[方法]以狗脊蕨叶片为材料,采用CTAB法、一步法、酚-SDS法和RNA试剂盒提取分离法提取总RNA,通过比较分析确定最优方法。[结果]这4种方法都能提取出182、8 S的RNA,但CTAB法和试剂盒提取分离法的总RNA质量较高,CTAB法还提取出清晰的5S RNA。一步法和SDS法带型模糊,有降解现象。CTAB法提取的狗脊蕨叶片总RNA质量较好,28S1、8S和5S条带清晰,且无明显降解。CTAB提取法OD260/OD280的值在1.93~2.06,试验中其OD260/OD280值为2.012,接近2.0,纯度较高。一步法和SDS法OD260/OD280>2.0,试剂盒法OD260/OD280<2.0。[结论]CTAB法适合提取的狗脊蕨叶片总RNA,质量较好,可用于cDNA合成、文库构建等后续分子生物学试验。     

玫瑰花柱总RNA提取方法的比较研究

为获得一种玫瑰(Rosa rugosa)花柱总RNA提取的理想方法,为后续相关基因工程研究奠定基础。以玫瑰花柱为材料,用核酸蛋白仪和凝胶电泳法比较了改良CTAB 法、Trizol 法以及EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的玫瑰花柱总RNA的纯度、浓度及完整性,利用RT-PCR反应检测了其反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明：改良CTAB法提取的总RNA纯度、浓度较高,但存在严重降解现象;Trizol 法提取的总RNA纯度和浓度极低;EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的总RNA纯度和浓度较高,条带清晰,且28S 条带亮度是18S 条带亮度的2 倍,将其反转录获得的cDNA用于RT-PCR,能够扩增出清晰的特异性条带。综上所述：EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法从玫瑰花柱中提取的RNA质量最好,完全能够满足后续的玫瑰分子生物学研究要求。     

香菇gpd启动子引导的云芝漆酶基因真核表达载体的构建

根据Genbank中提交的云芝(Coriolus versicolor (L.) Quel.)漆酶(lcc1)基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR获得云芝漆酶基因cDNA完整编码框,与GenBank中云芝漆酶基因同源性为96%;以pCAMBIA1381xb为初始载体,利用引物两端的酶切位点,将克隆得到的云芝漆酶基因cDNA序列分别连接到香菇gpd启动子Lg1和Lg2的下游,构建成香菇启动子引导的云芝漆酶基因真核表达载体pC-XG1-YZ-Lac和pC-XG2-YZ-Lac,利用冻融法将其转到了农杆菌EHA105中.