猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病原检测

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M、N基因、伪狂犬病毒和圆环病毒基因序列设计引物,分别应用RT-PCR和PCR方法对上海金山区某养殖猪场疑似为PRRS的送检样品进行检测,结果证实为PRRSV和圆环病毒混合感染。     

鸽疱疹病毒PCR检测方法的建立及试剂盒的研制

鸽疱疹病毒(PiHV1)感染是由I型鸽疱疹病毒引起的以幼鸽为主的一种常见病毒性传染病,临床上以鼻炎、结膜炎为主要特征。偶尔也会出现精神沉郁、食欲下降、腹泻、呕吐、神经症状。根据已发表的鸽疱疹病毒的基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增鸽疱疹病毒的引物,通过对PCR的退火条件的优化,建立了鸽疱疹病毒的PCR检测方法,对发病鸽子进行诊断。并研制出检测试剂盒,再进一步对该试剂盒的敏感性、特异性和稳定性进行了研究,证明该试剂盒具有很高的敏感性和特异性,并且在-20℃条件下可保存1年以上。     

鸽疱疹病毒PCR检测方法的建立及试剂盒的研制

鸽疱疹病毒(PiHV1)感染是由I型鸽疱疹病毒引起的以幼鸽为主的一种常见病毒性传染病,临床上以鼻炎、结膜炎为主要特征。偶尔也会出现精神沉郁、食欲下降、腹泻、呕吐、神经症状。根据已发表的鸽疱疹病毒的基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增鸽疱疹病毒的引物,通过对PCR的退火条件的优化,建立了鸽疱疹病毒的PCR检测方法,对发病鸽子进行诊断。并研制出检测试剂盒,再进一步对该试剂盒的敏感性、特异性和稳定性进行了研究,证明该试剂盒具有很高的敏感性和特异性,并且在-20℃条件下可保存1年以上。     

PRV和PCV2二重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。     

鸡源和鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒对鸽的致病性比较

为了比较鸡源、鸽源 VIb 亚型新城疫病毒（NDV ）对鸽的致病性差异,选取鸡源毒株 ZJ3和鸽源毒株WX－10－07－Pi,分别人工感染2月龄试验鸽。接种后,观察试验鸽的临床症状、病理剖解变化、喉气管和泄殖腔排毒以及组织学病变情况,结果发现,2株NDV均能导致接种鸽发病,发病率为100％,死亡率为0;WX－10－07－Pi感染组鸽泄殖腔排毒时间长,而且病毒检出率比其他组高;此外,在接种组鸽的多种组织器官中均可检测出病毒。试验结果表明,不同基因型NDV对鸽均有致病性,但致病力强弱与 NDV毒株特性有关;鸽源基因Ⅵb亚型NDV在鸽体内可长期带毒与排毒,且更易在鸽群中传播。     

新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。     

鸽新城疫灭活疫苗效力评价中实验鸽的筛选

为解决鸽新城疫灭活疫苗免疫效力评价中的标准鸽缺失问题,筛选满足要求的试验鸽。2019年3月对鸽场饲养管理和鸽群发病史情况进行调研,筛选合格鸽场;采血进行鸽新城疫抗体检测,排除高母源抗体鸽群;进一步检测鸽圆环、鸽腺病毒和鸽痘,排除感染上述易感病原鸽群;最后对选定的鸽隔离饲养一定时间,排除潜在的病原感染;采用筛选鸽进行鸽新城疫灭活苗免疫攻毒试验,验证是否满足试验的需求。通过调研,确定3家鸽场,从1月龄左右鸽群中随机选择50羽健康鸽进行检测,ND母源抗体为0～1∶32不等,均无鸽腺病毒感染,但有个别鸽存在圆环抗体或携带鸽痘病毒。从其中2家鸽场购回HI抗体≤1∶4,且无其他病原感染风险的鸽各25羽进行鸽新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验,血清学检测结果显示,免疫组鸽免后28 d ND HI抗体在1∶16～1∶64之间,均值在1∶32以上;攻毒保护结果为,免疫组17/20～19/20保护,对照组均5/5发病,3～4羽死亡。通过鸽场调研初筛、新城疫HI抗体检测、鸽常见病原检测、隔离观察等步骤筛选的实验鸽可满足鸽新城疫灭活疫苗效力评价试验的要求,且结果稳定可靠。通过该研究筛选的实验鸽,满足试验需求、提高研究结果的可靠性和重复性,并在保证鸽用疫苗质量方面具有重要意义。     

云南省勐腊县猪场PCV2和PCV3的感染状况

为更好地了解和监控云南省勐腊县猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的感染情况,应用PCR方法对2019年采集自该地区部分猪场的86份(血液样品59份,粪便样品27份)样品进行PCV2、PCV3抗原检测。结果表明:PCV2阳性检出率为36.05%,PCV3阳性检出率17.44%,二者混合感染率为15.12%。PCV2和PCV3在勐腊县呈一定的流行趋势,且混合感染率较高,应加强对该病的防控。     

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为300bp、420bp、680bp。敏感性、特异性结果显示,该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明,该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。     

马铃薯三种病毒的多重PCR检测方法构建(英文)

[目的]构建马铃薯A病毒(Potato virusA,PVA)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)3种马铃薯主要易受感染的病毒的多重PRC(multiplex PCR)检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX(Potato virus X)、PVM(Potato virus M)、PVS(Potato virus S)、PVV(Potato virus V),CMV(Cucumber mosaic virus)等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限:PVA为100落copies/2μl,PVY为100copies/2μl,TMV为1000copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。     

3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。     

猪圆环病毒2型与3型双重PCR检测方法的建立

【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。     

鸽圆环病毒Cap基因的克隆与进化分析

应用PCR方法对采集的144份血清样品进行鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)检测,随机选择6份阳性样品进行Cap基因的扩增、纯化,并克隆至pMD18-T载体.测序结果与已知参考毒株进行序列比对和系统进化分析.结果显示:PiCV阳性检出率为75％(108/144),说明PiCV的感染比较严重.自测的6株Cap基因核苷酸的同源性为74.0％～100.0％,与GenBank上登录的国内外14株的Cap基因的核苷酸同源性为72.1％～100.0％.通过进化树分析6株阳性样品分成两大分支:5株位于一大分支,亲缘关系较近;但HBLF株单独位于另外一大分支,与其它5株亲缘关系远.     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

广西规模猪场引起猪呼吸道疾病细菌性病原的检测

运用PCR方法结合细菌分离鉴定,对2008～2010年广西48家规模猪场采集的368份组织样品进行了猪链球菌(SS)、产毒素多杀性巴氏杆菌(T+PM)、败血性波士杆菌(Bb)和猪副嗜血杆菌(HP)病原学检测。结果显示:阳性组织样品101份,占27.45%(101/368);其中SS、T+PM、Bb和HP感染阳性样品分别占9.24%(34/368)、5.71%(21/368)、7.88%(29/368)和4.62%(17/368)。二重或多重混和感染样品共98份,占94.74%(98/101)。SS、T+PM、Bb和HP的混合感染样品分别为33、21、27和17份,多与猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染。可见SS、T+PM、Bb和HP在我区规模猪场依然存在,且常常与病毒尤其是PRRSV和PCV2以混合感染方式存在。     

PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。【方法】根据GenBank中收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列,选择3种病毒的特异性保守区设计3对引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行检测,并将其用于临床病料的检测。【结果】多重PCR方法中,当引物浓度均为1.0μmol/L,退火温度为57.2℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从PCV-2、PPV、PRV病毒DNA中分别扩增出长度为353,265和198bp的目的片段,从3种病毒DNA的混合物中也可扩增出上述目的片段,而其他对照组的扩增结果均呈阴性。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR方法对PCV-2、PPV和PRV的最低检测量分别为26.88,25.34和24.9pg/μL。在不同时间对每份样品重复检测3次,结果一致,表明该方法具有良好的可重复性。临床应用结果表明,39份疑似病料中,PCV-2、PPV和PRV的阳性率分别为53.84%,17.95%和5.13%,PCV-2与PPV混合感染的阳性率为15.38%,PCV-2、PPV和PRV混合感染的阳性率为2.57%。【结论】建立的多重PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可以有效检测PCV-2、PPV和PRV的混合感染。     

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的田间试验

为验证鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)对鸽子的安全性和免疫效果,对试制的5批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)分别在3家规模化养鸽场进行田间试验。结果表明:幼龄鸽、青年鸽和种鸽免疫鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)后均无任何不良反应,并产生了较高的抗体水平,免疫后180 d对鸽副黏病毒Ⅰ型强毒川沙株的攻毒保护率在90%以上。试验效果证明,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)安全有效。     

猪圆环病毒病的血清学及病原学检测

为贵州猪圆环病毒病的防治提供参考依据,对贵州省花溪区、息烽县和织金县3个地方3个猪场疑似猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)感染发病猪进行临床初步诊断,并分别采集6份血清及组织病料,采用ELISA和PCR技术对18份样品进行PCV2的血清学和病原学检测。结果表明:花溪、息烽、织金3个区(县)的PCV2阳性率分别为33.3%、83.3%和66.7%,3个猪场均出现了PCV2病毒感染,猪圆环病毒贵州流行毒株与Shanghai-06株的亲缘关系最近。