马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

黑龙江省马铃薯新病毒株系调查研究

2009年通过对黑龙江省20余个县市马铃薯主产区的马铃薯病叶采集,经鉴别寄主反应、血清学测试、电镜观察、新病毒检测技术等,较全面地了解了黑龙江省马铃薯病毒（包括病毒株系）存在和分布情况。系统鉴定出马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）、马铃薯Y病毒（Ptato virus Y,PVY）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaic virus,CMV）、烟草花叶病毒（Tobacoo mosaic virus,TMV）、烟草脆裂病毒（Tobacoo rattlevirus,TRV）和马铃薯Y病毒坏死株系（PVYn）。TRV,PVYn为局部分布。研究证实至2009年黑龙江省无马铃薯黄矮病毒（Potato yellow dwarf virus,PYOD）、马铃薯V病毒（Potato virus V,PVV）、马铃薯帚顶病毒（Potato mop top virus,PMTV）和安第斯马铃薯潜隐病毒（Andean potato latentvirus,APLV）、安第斯马铃薯斑驳病毒（Andean potato mottlevirus,APMV）的分布,没有发现侵染马铃薯的番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）和苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）。检测到马铃薯番茄黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）、马铃薯烟草花叶病毒黄斑株系和马铃薯PVYNTN病毒皆呈零星分布。     

黑龙江省马铃薯病毒病的普查及鉴定

通过对黑龙江省近30个县市马铃薯主产地的系统调查采样,经鉴别寄主反应、血清学测试、电镜观察、种薯传毒试验,系统鉴定出马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Ptato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)、马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacoo mosaic virus,TMV)、烟草脆裂病毒(Tobacoo rattle virus,TRV)、马铃薯Y病毒坏死株系(PVYn);标样K-04和番茄黑环病毒(Toma-to black ring virus,TBRV)有强烈的阳性反应,球形粒体,直径约30 nm,但在田间表现蕨叶症状,可认为该标样疑似番茄黑环病毒引起,或可能携带番茄黑环病毒。TRV,PVYn为局部分布,马铃薯蕨叶病呈局部零星发生。经研究证实至2005年黑龙江省无马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarf virus,PYOD)马铃薯帚顶病毒(Potato mop top virus,PMTV)、安第斯马铃薯潜隐病毒(Andean potato latent virus,APLV)、安第斯马铃薯斑驳病毒(Andean potato mottlevirus,APMV)、马铃薯V病毒(Potato virus V,PVV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)的分布,没有发现侵染马铃薯的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)。     

马铃薯M病毒微滴数字PCR检测方法的建立

为了建立马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)的精准检测技术,根据PVM外壳蛋白基因核苷酸保守序列设计微滴数字PCR(dd PCR)的引物、探针,建立PVM的dd PCR检测技术。以田间采集并经RT-PCR验证的PVM及其他4种同样可侵染马铃薯的病毒(PVX、PVY、CMV、TMV)总RNA为模板,进行dd PCR特异性分析;对PVM的总RNA进行10倍梯度稀释并用作模板,进行dd PCR灵敏度测定。结果表明,建立的dd PCR方法可以特异性地检测马铃薯上的PVM,与实时荧光RT-PCR结果一致;最低可检测5.7 fg/μL的总RNA,比实时荧光RT-PCR灵敏度高100倍。说明建立的dd PCR检测方法可用于PVM的准确鉴定。     

用小RNA深度测序鉴定广西冬种马铃薯病毒

【目的】对广西冬种马铃薯病毒进行鉴定,为无病毒种薯选择和大田防治提供依据。【方法】2012年在马铃薯主要产区采集具有明显病毒病症状的样品,在血清学ELISA检测的基础上,进一步用小RNA深度测序对按症状分类的样品进行混合样本的病毒种类鉴定,再用RT-PCR方法对分组混合样本进行验证。【结果】在109个样本中检测到马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯H病毒（Potato virus H,PVH）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）,同时发现PVS有丰富的株系分化。【结论】近年广西冬种马铃薯病毒种类增多,病症多样,亟需加强种薯管理,培育无毒健康种薯。     

我国马铃薯主产区病毒病发生情况调查

为了解我国马铃薯病毒病发生情况,在马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、云南等马铃薯田采集了具有典型病毒病症状的样品、疑似样品和随机无症样品,试管苗和原原种为随机样品,共649份。应用DASELISA方法筛查6种马铃薯主要病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明:129份样品为阳性,PVY的检出率最高,为9.86%,PVS次之,为6.47%;试管苗PVS检出最多,为32份,原原种PVX检出最多,为10份,大田样品PVY病毒发生比例最高,为54份;有38份样品是由多种病毒复合侵染造成的,大田PVY+PVS复合侵染率最高,为2.93%,PVS+PVY+PLRV次之,为0.98%,试管苗PVS+PVM复合侵染率最高,为4.85%。通过历年的检测结果比较,试管苗中PVS病毒检出率最高,原原种中PVX和PLRV病毒成为危害最为严重的病害,大田样品中PVY检出率一直居高不下。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

马铃薯主产区病毒病发生情况调查

为明确马铃薯病毒病的发生特点,对中国10个马铃薯主产区进行病毒病发生情况调查。随机抽取马铃薯脱毒试管苗、原原种、大田种薯样品共1 330个,应用血清学DAS-ELISA方法对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA 6种病毒进行实验室检测。初步分析了马铃薯各级种薯病毒病的发生情况,并与2004~2006年病毒病的发生情况进行了比较分析。     

中国马铃薯主要病毒病发生情况调查与分析

马铃薯病毒病是造成马铃薯减产的主要因素,为了解中国马铃薯种薯质量及生产中病毒病发生情况,在马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、河北等地采集具有典型病毒病症状的样品、疑似病毒样品和随机无症样品,包括试管苗样品248个,原原种样品93个,大田种薯样品621个,共计962个。应用DAS-ELISA方法检测6种马铃薯主要病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明,219份样品病毒检测结果呈阳性,PVS检出率最高,PVY次之。有10个样品是由多种病毒复合侵染造成。不同级别种薯质量情况为试管苗PVS病毒发生较多,原原种质量较好,大田种薯PVY病毒发生比例最高。     

河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。     

福建长汀小米椒病毒病的病原鉴定

1987—1988年从小米椒的主要产地长汀县采回具有花叶、叶片斑驳、皱缩、畸形.叶脉肿大、黄化、小叶和侧枝丛生等病株的标样189份,经5科10种鉴别寄主的传染性试验、血清学反应(酶联免疫吸附测试)和电子显微镜观察,鉴定出4种小米椒病毒病原:马铃薯 X 病毒(PVX),马铃薯 Y 病毒(PVY),烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV).其中复合感染的样本占42.9%,病毒病原为 PVX,PVY 2种或 PVX,PVY,TMV 3种病毒的复合感染,其中以 PVX,PVY TMV 3种病毒感染占优势,为29.75%,是为害小米椒的主要毒源种类;单独浸染的样本88份,占46.6%,其中 PVX 占18.1%,PVY13.9%,TMV9.06%,CMV5.5%;未知病原样本20份占10.6%.     

马铃薯病毒疫情调查及马铃薯S病毒的检测鉴定

[目的]了解河北省张家口市马铃薯病毒病害发生情况并对马铃薯S病毒（PVS）进行鉴定。[方法]对采自河北省张家口市的46份马铃薯样品进行生物学测定和血清学及分子生物学检测。[结果]46份样品中有35份为马铃薯Y病毒（PVY）侵染,其中有6份是PVY与PVS混合侵染,其余29份为PVY单独侵染。用特异性引物扩增PVS外壳蛋白基因的部分序列,获得685bp的目的产物,该序列与已报道的PVS核苷酸序列同源性在80％以上,编码227个氨基酸,与已报道的PVS外壳蛋白的氨基酸同源性均在90％以上。证明该样品中确实携带PVS。[结论]该研究为今后该地区马铃薯病毒病害的控制及防治提供了依据。     

马铃薯Y病毒株系分化研究进展

马铃薯Y病毒(PVY)是我国马铃薯上最重要的病毒之一,分布广泛,危害严重.PVY株系分化现象明显,已被广泛认同的PVY株系种类包括3种:PVYO株系、PVYN株系和PVYC株系.近年来,有很多研究表明,PVY可通过基因突变或基因重组等方式分化出多种不同类型的株系,引致更为严重的症状.鉴此,从PVY各株系的特征、产生的分...     

PVYN与PVYO病毒RT-PCR快速检测体系研究

 马铃薯Y病毒（PVY）是侵染马铃薯的重要病毒之一，严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系（PVYN）与O株系（PVYO）的基因序列进行比较，在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物，建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物，选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物，建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立，对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。     

PVY/PVX协生作用对病毒浓度及寄主细胞超微结构的影响

 以烟草品种三生烟 (N .tabacumcv .Samsun)为测试寄主 ,采用酶联免疫检测实验 (TAS ELISA)和电镜观察的方法 ,在温室条件下研究了马铃薯Y病毒 (PVY)和马铃薯X病毒 (PVX)复合侵染所引起的寄主症状和病毒浓度变化的特点、不同条件下复合侵染时病毒浓度的变化规律以及复合侵染对寄主细胞超微结构的影响。结果表明 ,PVY/PVX在烟草植株内发生了协生作用 ,PVY是协生病毒 ,PVX是被协生病毒。与单独侵染相比 ,PVY和PVX的复合侵染使烟草植株症状明显加重。PVY在复合侵染植株中的浓度与在单独侵染植株中相比 ,没有明显的变化 ,而PVX在复合侵染植株中的浓度明显高于在单独侵染植株中的浓度。这种现象不受PVY株系、处理季节和接种次序的影响。但是 ,不同PVY株系、不同处理季节或不同接种次序对PVY/PVX协生作用中PVX浓度的影响程度存在着一定的差异。电镜观察表明 ,与不接种病毒或单独侵染的植株相比 ,受复合侵染的烟草叶片细胞超微结构发生了明显的病理学变化。细胞肿胀 ,叶绿体、线粒体等细胞器受到严重损伤 ,细胞质内有风轮状、薄片状的内含体 ,由于在细胞质中常常有大量纤维状的PVX病毒粒子聚集体存在 ,这意味着PVX浓度的增加可能是在复合侵染的细胞中病毒大量繁殖的结果。     

贵州不同海拔地区马铃薯病毒病初步调查及检测鉴定

[目的]调查贵州省不同海拔地区马铃薯病害发生情况,鉴定出贵州省马铃薯易感病毒种类。[方法]采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)对在黔南州、黔东南州及毕节地区采集的805份马铃薯样品进行病毒检测。[结果]805份马铃薯样品中检出有29份马铃薯X病毒(PVX)为阳性;41份马铃薯Y病毒(PVY)为阳性;285份马铃薯S病毒(PVS)为阳性;23份马铃薯卷叶病毒(PL-RV)为阳性,带病毒率46.95%。[结论]对贵州马铃薯危害较重的病毒种类依次为:马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)。