PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。【方法】根据GenBank中收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列,选择3种病毒的特异性保守区设计3对引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行检测,并将其用于临床病料的检测。【结果】多重PCR方法中,当引物浓度均为1.0μmol/L,退火温度为57.2℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从PCV-2、PPV、PRV病毒DNA中分别扩增出长度为353,265和198bp的目的片段,从3种病毒DNA的混合物中也可扩增出上述目的片段,而其他对照组的扩增结果均呈阴性。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR方法对PCV-2、PPV和PRV的最低检测量分别为26.88,25.34和24.9pg/μL。在不同时间对每份样品重复检测3次,结果一致,表明该方法具有良好的可重复性。临床应用结果表明,39份疑似病料中,PCV-2、PPV和PRV的阳性率分别为53.84%,17.95%和5.13%,PCV-2与PPV混合感染的阳性率为15.38%,PCV-2、PPV和PRV混合感染的阳性率为2.57%。【结论】建立的多重PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可以有效检测PCV-2、PPV和PRV的混合感染。     

多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

PRV和PCV2二重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。     

检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立

[目的]为快速诊断猪圆环病毒病提供参考。[方法]根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,建立诊断PCV-2地方分离株的PCR方法。[结果]各物质在PCR反应中最佳浓度分别为:dNTP 220 pmol/ml,Taq酶0.1 U/μl,引物20 pmol/μl。从PCV-2阳性病料中提取DNA,在优化条件下进行PCR扩增,获得预期的494 bp特异性条带。用该PCR方法对PCV-2、PRRSV、HCVS、IV、PPV进行检测,PCV-2为阳性,而PRRSV、HCV、SIV、PPV检测均为阴性,未出现交叉反应,说明该PCR方法对PCV-2具有良好的特异性。该PCR方法可检出1.25 ng模板DNA,具备较高的敏感性。[结论]使用该PCR方法检测PCV-2是切实可行的。     

3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。     

猪繁殖障碍疫病的三重PCR法鉴别诊断

为建立一种简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）3种病原的多重PCR方法，针对PRRSVN基因、PPVVP2基因及PRVgp50基因分别合成了1对特异性引物，通过PCR均扩增出分子长377bp、445bp和217bp的DNA条带，与预期扩增片段相符。以3对引物同时对PRRSV、PPV和PRV疫苗株进行多重PCR扩增及反应条件的优化，同时扩增出3条特异性条带。利用所建立的多重PCR方法，对贵州省11个养猪场的40份疑似病料进行检测，结果显示，PRRSV、PPV和PRV的阳性检出率分别为62．5％、17．5％和0％。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、 特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。     

猪日本乙型脑炎及猪细小病毒复合PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)与猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)参考基因序列,设计合成2对特异性引物,在建立优化单项PCR检测方法的基础上,建立了PPV-JEV复合PCR检测方法,可扩增出预期的238 bp和152 bp特异性片段。该方法敏感性高、稳定性好、特异性强,临床样品检测结果与单项PCR检测结果符合率100%,该方法适合JEV和PPV的联合检测和鉴别诊断。     

SYBR Green I实时定量PCR方法检测2型猪圆环病毒

利用PCR技术扩增出2型猪圆环病毒(PCV)ORF2保守区基因107 bp片段,并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。再以提取的PCV-2、PCV-1、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR检测。结果表明:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与样本阈值循环数(Ct)值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2为0.997,Ct值为11.9~26.9。PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于104拷贝.μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于105拷贝.μL-1。实时荧光定量PCR方法可用于2型猪圆环病毒定性及定量的检测。     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。     

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。     

猪圆环病毒PCR实验报告研讨

根据猪圆环病毒2型（PCV-2）01KF1基因序列，设计并合成了一对特异性引物，以PCV-2为模板，建立了检测PCV-2的PCR方法。用本方法对猪细小病毒（PPV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRR-SV）及PK-15细胞进行同条件检测．均未有条带出现，结果均为阴性。表明该方法具有良好的特异性：敏感性试验表明，该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为4．2pg；对保定、安新、定州、正定送检的四份临床样品进行检测。检测结果表明，四份临床样品均呈阳性。     

猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品.通过对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒.试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL.结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测.     

猪传染性胃肠炎及流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的序列,利用Primer 5.0设计合成了2对特异性引物。用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化,然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件,结果同时扩增到2条与实验设计相符的492bp(PEDV)和211bp(TGEV)特异性条带,建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法,可检测出约11pg的PEDV和13pg的TGEV。     

猪细小病毒和猪伪狂犬病毒复合PCR检测方法的建立

在已经建立的PPV和PRV的单项PCR诊断方法的基础上。通过对扩增条件的筛选，成功地建立了PPV和PRV诊断方法，并应用于临床，利用一次PCR反应，即可同时扩增PPV的445bp和PRV217bp的特异性片段。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

猪繁殖障碍性疫病多重PCR诊断方法的建立及其应用

根据GenBank已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的序列,经DNAstar生物学软件和BLAST序列分析,利用Oligo6.0软件分别设计并合成了4对特异性扩增引物.在初步优化单项PCR反应退火温度和反应体系的基础上,建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法.结果表明:该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性;对30份临床样品进行检测,结果发现,CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的阳性率分别为46.7%、43.3%、53.4%、10.0%,其中,PRV与PCV2、CSFV与PCV2和CSFV与PRRSV混合感染的阳性率分别为6.7%、36.7%和10.0%;PRV、PCV2和PRRSV单一感染的阳性率分别为3.3%、10.0%和33.3%.说明所建立的多重PCR诊断方法,可以应用于CSFV、PRRSV、PCV2和PRV混合感染所引起的猪繁殖障碍性疫病的临床鉴别诊断.     

猪圆环病毒 2型 LAMP 诊断方法 的建立及初步应用

根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩 增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP 诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样 品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结 果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。     

CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)基因保守序列,设计2对特异引物,通过对最佳反应条件的优化,建立了CSFV和PRRSV的二联RT-PCR检测方法,该方法可同时扩增得到2条与试验设计相符的443 bp(CSFV)和246 bp(PRRSV)特异性条带。应用该二联RT-PCR方法检测猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结果均为阴性,证明该方法有良好的特异性。将已知阳性病毒PCR模板最高稀释倍数作为PCR的敏感度,结果表明该二联RT-PCR体系扩增的敏感度为10-3,可对CSFV和PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。