球孢白僵菌对烟粉虱后代生命表参数的亚致死影响

【目的】关于昆虫病原真菌对昆虫生命表亚致死影响的研究较少,而由真菌侵染所产生的亚致死影响对于寄主昆虫的种群动力学至关重要,并最终影响着目标昆虫的害虫地位。论文旨在比较烟粉虱（Bemisia tabaci）亲代3龄若虫经球孢白僵菌（Beauveria bassiana）处理及对照子代种群的生命表参数,探讨球孢白僵菌对烟粉虱生命表参数的亚致死影响。【方法】应用年龄-阶段两性生命表分析经球孢白僵菌处理的烟粉虱后代的发育历期、存活率和繁殖率数据,以蒸馏水处理的个体作为对照。应用bootstrap方法计算种群生长参数的平均数和标准误;采用t-test比较分析球孢白僵菌处理组和对照组烟粉虱的种群参数、发育历期和繁殖力间的差异。【结果】球孢白僵菌处理的烟粉虱与对照之间在成虫前期、总产卵前期、1-4龄若虫存活率和生命表参数上存在着显著差异。与对照处理的烟粉虱成虫前期（20.59 d）相比,亲代接种球孢白僵菌使后代个体的成虫前期显著延长（26.58 d）。经球孢白僵菌处理的烟粉虱后代存活率（0.195）要比对照个体（0.76）低。球孢白僵菌处理烟粉虱后代种群的内禀增长率（r）、周限增长率（λ）、净增殖率（R₀）、平均世代时间（T）和总繁殖率（GRR）分别为0.063 d^-1 、1.065 d^-1、6.85,30.613 d和41.883,而对照烟粉虱后代种群的上述参数分别为0.137 d^-1 、1.147 d^-1、33.443、25.575 d和51.44。【结论】亲代经球孢白僵菌处理的烟粉虱其子代种群增长要比对照组慢,死亡率高,但生殖能力并无显著性影响。该研究可为了解昆虫病原真菌对烟粉虱的长期影响提供理论依据。     

烟粉虱味觉受体基因BtabGR1和BtabGR2的克隆与表达模式分析

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫,寄主植物种类众多,但对不同寄主植物存在嗜性差异,而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因,明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性,为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列,利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2,运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测,基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树,并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905）,完整开放阅读框为1 287和1 344 bp,分别编码428和447个氨基酸,预测蛋白分子量为 48.54和51.50 kD,理论等电点为8.85和8.74,具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,BtabGR1 和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达,其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期,而BtabGR2在卵中的表达量最高;组织表达谱结果表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达,且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征,二者均在烟粉虱成虫头部高表达,推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用,可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。     

家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2的克隆及其功能分析

【目的】 克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2,探明其表达模式和生物学功能。【方法】 基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达,以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】 Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp,编码402个氨基酸,含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区,且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支,其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin2表达具有明显的时空特异性,其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期,且在雄成虫中表达量最高;卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄）,其中3龄若虫期最低;Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达,且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比,Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%,且均达到显著水平。【结论】 Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用,可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。     

种间竞争对烟粉虱和桃蚜生长发育及繁殖力的影响

【目的】研究烟粉虱Bemisia tabaci与桃蚜Myzus persicae的种间竞争。【方法】在(26±1)℃的条件下,设置了1∶1、1∶5和1∶10的种间竞争比例,调查烟粉虱和桃蚜的发育历期、存活率、成虫寿命及产卵/仔量情况。【结果】种间竞争延长了烟粉虱1~2龄若虫发育所需的时间,但对整个若虫期的发育速度影响不大。烟粉虱∶桃蚜为1∶1、1∶5时对烟粉虱若虫的存活率影响较小,但缩短了烟粉虱雌成虫的寿命、降低了其产卵量;而烟粉虱∶桃蚜为1∶10明显降低了烟粉虱若虫期的存活率,延长了烟粉虱雌成虫的寿命,提高了其后代繁殖量。种间竞争明显延长了桃蚜若虫期的发育时间,降低了若虫期的存活率。相对而言,桃蚜∶烟粉虱为1∶1、1∶5时,桃蚜成虫的寿命有所缩短,但对其单雌产仔量影响较小;桃蚜∶烟粉虱为1∶10显著延长了桃蚜雌成虫寿命的同时,降低了其单雌产仔量。【结论】生态位重叠的昆虫的种间竞争对昆虫种群数量影响很大,有时甚至会发生种间的竞争取代。     

Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

烟粉虱对几种药剂的敏感度检测及其抗药性相关基因的表达特征分析

为筛选有效防治烟粉虱的药剂,采用琼脂保湿浸叶法,比较了烟粉虱成虫对生产上广泛喷施的5种药剂5%锐劲特、2.5%高效氯氟氰菊酯、4%阿维菌素、70%艾美乐、25%噻嗪酮的敏感性。对比得出烟粉虱对4%阿维菌素的敏感性较好,药剂处理72 h后成虫校正死亡率高达98.01%。70%艾美乐次之,烟粉虱成虫校正死亡率达80.91%。2.5%高效氯氟氰菊酯较差,处理72 h后成虫死亡率40.73%。25%噻嗪酮最差,处理烟粉虱成虫72 h后死亡率低于5.00%。CYP6CM1、Coe1基因分别是烟粉虱对吡虫啉类药剂、有机磷类药剂产生抗药性的重要响应基因,应用Semi-quantitive PCR检测药剂处理72 h烟粉虱成虫CYP6CM1和Coe1基因转录水平表达量变化。发现70%艾美乐处理后,CYP6CM1基因表达量显著升高,Coe1基因表达量与药剂处理前无明显差异。4%阿维菌素处理后,CYP6CM1基因表达量显著下降,Coe1基因表达量与药剂处理前无明显差异。2.5%高效氯氟氰菊酯处理后CYP6CM1基因表达量变化不大,Coe1基因表达量稍有增加。25%噻嗪酮处理后CYP6CM1基因表达量稍有增加,Coe1基因表达量略有下降。不同药剂对烟粉虱的防治效果与烟粉虱解毒酶基因(CYP6CM1、Coe1)的表达响应有一定的关系。     

不同农业种植环境番茄地烟粉虱种群动态及空间分布

[目的]明确烟粉虱在不同农业种植环境番茄地中的发生情况及空间分布特点,为制定烟粉虱的生态调控措施提供科学依据.[方法]在云南省昆明市滇池流域范围内的番茄种植区中选取城郊、花卉、河流和山地4种不同类型农业种植环境,采用五点取样法对番茄地烟粉虱种群密度及空间分布情况进行系统调查,利用四分位法分析烟粉虱在不同农业种植环境中的发生情况,运用聚集度指标、Iwao回归模型和Taylor幂法则分析烟粉虱成虫和若虫种群在不同农业种植环境番茄地中的空间分布型,并利用种群聚集均数分析其聚集原因.[结果]花卉农业种植环境番茄地中烟粉虱成虫和若虫的种群密度最小;河流农业种植环境番茄地中烟粉虱成虫和若虫的种群密度最大,主要发生期的种群密度成虫为32.47头/叶,若虫为49.42头/叶.不同农业种植环境番茄地中烟粉虱种群均呈聚集分布,聚集原因主要由烟粉虱周围环境中作物和非作物生境等综合因素引起.在烟粉虱的主要发生期,4种农业种植环境番茄地中烟粉虱主要分布在番茄地的边缘区域;烟粉虱成虫在番茄植株的上部叶片分布最多,中部叶片次之,下部叶片最少;烟粉虱若虫在番茄植株上总体表现为中部叶片分布最多,下部叶片次之,上部叶片最少.[结论]不同农业种植环境番茄地中烟粉虱种群均呈聚集分布,聚集原因主要由周围环境中作物和非作物生境等综合因素引起.显花植物种植比例较高的花卉农业种植环境类型对烟粉虱的自然调控作用较好,合理布局农业种植环境如增加显花植物的种植比例可有效抑制烟粉虱的暴发.     

寄主种植密度对烟粉虱种群动态影响及化学防治

2008年在上海市研究了番茄和黄瓜的种植密度对烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)种群动态的影响和化学防治方法.结果表明,烟粉虱的种群数量在寄主的生育期内持续增长.在不同密度条件下,在发生高峰期,番茄和黄瓜上烟粉虱成虫及4龄若虫数量比较为:低密度>正常密度>高密度.在药效试验中2.2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂3 000倍和10%烯啶虫胺水剂2000倍的处理,对防治烟粉虱成虫具有较好的效果.     

29株虫生真菌的鉴定及对烟粉虱的毒力

【目的】对29株虫生真菌菌株进行分类学鉴定并筛选出对烟粉虱Bemisia tabaci具有高毒力的菌株。【方法】采用形态学及ITS区、TEF区、Bloc区基因序列相似性分析鉴定菌株,并采用浸渍法测定真菌对烟粉虱的毒力。【结果】29株虫生真菌有26株符合白僵菌Beauveria的特征,菌株SB003、SP665和SP670被鉴定属于棒束孢属Isaria;利用TEF区序列、Bloc区序列、TEF-Bloc联合序列构建的系统发育树,结果显示29株菌株共包括24株球孢白僵菌B. bassiana、2株假性球孢白僵菌B. pseudobassiana和3株环链棒束孢I. cateinannulata。烟粉虱2龄若虫的死亡率随孢子浓度的增加而增加,不同菌株致病力不同;用1×108 mL-1的孢子悬浮液处理烟粉虱2龄若虫7 d,致死率最高的菌株为SP433,其次为SB009,分别为87.37%和82.93%。【结论】本研究可为虫生真菌的分类提供理论基础,筛选出的高致病力菌株SP433和SB009可为烟粉虱的生物防治提供参考。     

大草蛉幼虫对烟粉虱的捕食功能反应及捕食行为观察

 【目的】评估大草蛉(Chrysopa pallens)对烟粉虱(Bemisia tabaci)卵、若虫及伪蛹的搜寻、控害潜能,观察分析其捕食行为。【方法】在室内设置不同密度的烟粉虱卵、若虫及成虫供大草蛉高龄幼虫取食,统计大草蛉3龄幼虫在不同猎物密度下的净取食和取食比例,并进行相关统计分析。观察大草蛉3龄幼虫的取食行为的若干独立行为事件,系统描述其行为事件内容,分析研究各行为发生频次及持续时间占总捕食过程的比例。【结果】大草蛉3龄幼虫对烟粉虱卵、若虫及伪蛹的捕食功能反应均同时拟合Holling II及III型方程。在室内条件下,大草蛉3龄幼虫的捕食量随猎物密度的增加而上升,其瞬间攻击率随烟粉虱虫龄的增加而增大,且处理时间为若虫＞伪蛹＞卵,最佳寻找密度为若虫最低。对搜寻效应的估计结果表明,大草蛉幼虫对烟粉虱的搜寻效应随烟粉虱虫龄的增加而升高。大草蛉取食卵及若虫时,其行走及搜索行为所占比例相当,而取食伪蛹时搜索行为所占比例最高而取食其次。同时,在捕食过程中,各行为事件的发生比例也存在显著差异。【结论】大草蛉高龄幼虫在低密度下对烟粉虱卵、若虫及成虫的捕食能力随密度增长且不受密度制约,其捕食行为事件的发生频次及持续时间在取食不同类型猎物时差异显著。     

二斑叶螨多重抗性品系解毒酶基因表达模式解析

【目的】二斑叶螨（Tetranychus urticae）是一种重要的农业害螨,由于个体小、繁殖快等特点,极易产生抗药性,论文从生理生化和分子水平探讨二斑叶螨mRNA水平相对表达量的变化,旨在明确二斑叶螨对混剂的多重抗性机制,为该螨的综合治理提供依据。【方法】在温度（25±l）℃,相对湿度60%±5%,光周期L﹕D=16 h﹕8 h的室内条件下,于盆栽豇豆苗上饲养不接触任何药剂的二斑叶螨敏感品系（SS）和用螺螨酯、甲氰菊酯、阿维菌素以其单剂的致死中浓度（LC50）为汰选浓度混合连续汰选的多重抗性品系（Mp-R）;Mp-R品系用药4-5次待其种群扩增后,参照FAO推荐的叶片残毒法进行室内毒力测定一次,计算其LC₅₀,求出抗性倍数（RR）,并记为一个汰选周期;连续汰选3个周期后,逐渐增加汰选浓度,用PoloPlus软件求其毒力回归方程、LC50、抗性指数及卡方值;采用生化分析法测定选育50代的二斑叶螨SS与Mp-R品系卵、幼螨、若螨、雄成螨、雌成螨的谷胱甘肽S转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarEs）、多功能氧化酶（MFOs）的活性,以ELFn为内参基因,采用RT-qPCR技术以比较Ct值的方法计算二斑叶螨Mp-R品系中10个与抗性相关的解毒酶基因的表达量。【结果】在室内经50代抗性选育,二斑叶螨对阿维菌素、甲氰菊酯及螺螨酯的LC₅₀分别达到1 103.55、5 993.33和2 345.62 mg·L^-1,抗性倍数分别为603.03、167.65和51.77倍。卵中Mp-R品系MFOs比活力显著高于SS品系,GSTs、CarEs比活力差异不显著;其他发育阶段Mp-R品系的GSTs、CarEs比活力显著高于SS品系,MFOs比活力则差异不显著;Mp-R品系雌成螨的GSTs、CarEs比活力显著高于其他发育阶段,卵的MFOs比活力显著高于其他发育阶段。与敏感品系相比,二斑叶螨TuGSTd05、TuGSTd06与TuGSTd09基因表达量在Mp-R品系各发育阶段显著上调1.80倍以上,TuGSTd01表达量在若螨期显著上调1.63倍,其他发育阶段差异不显著;CYP392E10表达量在卵中极显著上调5.87倍,幼螨、若螨阶段显著上调2.15倍和2.09倍,成螨阶段表达量差异不显著;CYP392A6在卵、幼螨与若螨阶段表达量均显著上调1.89、1.64和1.59倍,在成螨阶段表达量差异不显著。CYP392A16在各发育阶段均极显著上调,卵中上调6.97倍,幼螨中上调8.20倍,若螨中上调8.88倍,雄成螨上调7.34倍,雌成螨上调8.59倍。CYP392D 8在卵、幼螨和雄、雌成螨中表达量均显著上调2.18、2.00、2.03和2.41倍,在若螨阶段表达量差异不显著;TuCCE35在若螨及雄、雌成螨中表达量显著上调1.58、1.86和2.65倍;TuCCE36在卵和雄、雌成螨中表达量显著上调1.73、1.89和2.14倍。【结论】与敏感品系相比,二斑叶螨Mp-R品系10个与抗性相关的解毒酶基因表达量在其不同发育阶段均有不同程度的变化。CYP392A16表达量在各发育阶段上调较大,可能参与了二斑叶螨多重抗性的形成;其余基因表达量均未见大幅度上调,这些基因是否参与了对3种药剂的代谢还需进一步验证。     

超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果(Malus domestica‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和PCR技术,分离细胞分裂素响应基因Md CRF6。使用MEGA 5.0软件构建苹果Md CRF6与拟南芥CRFs间系统进化树;通过SMART软件和DNAMAN软件分析Md CRF6蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应。通过电泳迁移率试验(EMSA),验证Md CRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建Md CRF6植物超表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md CRF6苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定Md CRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域,在C端包含保守的AP2/ERF结构域,并且与拟南芥At CRF6同源性最高。基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl处理3 h和6 h时表达量最高。EMSA试验结果验证Md CRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列。在苹果愈伤组织中超表达Md CRF6,发现Md CRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示,Md CRF6显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果Md CRF6与拟南芥At CRF6具有高度的同源性,其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达Md CRF6抑制其花青苷积累,降低植物抗盐性。推测苹果Md CRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调节花青苷积累和抗盐性。     

飞蝗几丁质酶5-1抗体制备及表达特性分析

【目的】通过制备飞蝗（Locusta migratoria）几丁质酶5-1（LmCht5-1）的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA 软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗cDNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体pET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到pET32a-OVA载体构建pET32a-OVA-LmCht5-1;将pET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21（DE3）中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射dsLmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471-533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得pET32a-OVA和pET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 kD;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射dsLmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射dsLmCht5-1和dsGFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。dsLmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。     

斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达

【目的】实现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达,以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白,为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析,经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因,亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以IPTG进行诱导表达,并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp,共编码196个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp,共编码191个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽,而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构,但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中,Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近,而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。将合成的斑马鱼g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞,20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h,可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2,纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL,对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。【结论】鱼类g型溶菌酶的基因变异较保守,经密码子优化及全基因合成方式合成的斑马鱼g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通过原核表达获得高纯度、高溶菌活性的融合蛋白,为探究斑马鱼溶菌酶的抗菌机制提供了技术支持。     

枳NLP转录因子克隆及其在不同水分条件下的表达

【目的】分析柑橘砧木枳（Poncirus trifoliata (L.) Raf.）参与氮素吸收与同化的重要转录因子NLP在干旱胁迫下的表达模式,为柑橘在干旱胁迫条件下对氮素吸收与同化的调控机理提供研究参考。【方法】以柑橘砧木枳为试验材料,在甜橙（Citrus sinensis (L.) Osb.）基因组数据库的基础上,利用生物信息学筛选获得甜橙NLP,并以此设计引物扩增枳NLP的CDS全长并测序。利用ClustalX和MEGA程序进行序列比对和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR技术分析不同水分条件下的枳NLP的表达模式。【结果】筛选并克隆获得了4条枳NLP序列,为PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7和PtNLP8。序列比对分析表明枳NLP之间的蛋白质序列一致性为45.13%,均具有明显的RWP-RK和PB1结构域。枳与甜橙的NLP蛋白质序列的一致性极高,分别为97.57%、96.47%、99.0%及97.33%。系统发育分析表明枳NLP可分为4个进化类型,与拟南芥的NLP分类一致,即PtNLP2与AtNLP1/2一类,PtNLP4与AtNLP4/5一类,PtNLP7与AtNLP6/7一类,PtNLP8与AtNLP8/9一类。在不同水分条件下,枳NLP的表达模式在叶与根中存在差异。随着基质水分含量的减少,枳叶NLP呈现先上升再下降的趋势。与对照（相对持水量为61.0%）相比,叶PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8的表达量在相对持水量为15.4%时上调至最高水平,分别上调了2.9、3.5、5.9及2.8倍,之后持续下调;到相对持水量为9.4%时,其表达水平低于对照但无显著差异。而枳根NLP的表达量在对照中最高,后随着水分的散失呈总体下降趋势且差异显著,与对照相比,根PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8的最大下调倍数分别为6.7、2.8、4.8及2.3。复水后,枳叶与根NLP的表达量低于复水前,且与对照差异显著。【结论】枳NLP的表达与土壤的水分条件密切相关。枳叶片NLP的表达水平在干旱胁迫前、中期上调,后期下调;而枳根NLP的表达水平在干旱胁迫下持续下调。其中,PtNLP2和PtNLP7的表达量在枳根响应干旱胁迫中变化较大。     

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据分析,获得一个MYB转录因子GmMYB111;以盐胁迫处理的cDNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因cDNA编码序列;根据GmMYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与GmMYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用 MEGA5.05对GmMYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析GmMYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱（DGEP）数据获得盐胁迫响应显著上调（27倍）的GmMYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB76、GmMYB12a以及苜蓿MtMYB61的亲缘关系最近; GmMYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,GmMYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,GmMYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,GmMYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示GmMYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,GmMYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】GmMYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。     

水稻颖花开放前浆片转录组变化

【目的】水稻颖花开放是由其基部的一对浆片吸水膨大所启动。测序技术的发展为从细胞整体水平研究浆片对颖花开放的分子响应,从而对掌握浆片调控颖花开放的内在分子机制提供更为快速、有效的方法。【方法】以常规籼稻品种中早25为材料,应用Illumina测序技术对水稻颖花开放前12 h和临开放前1 h 2个时间点的浆片转录组进行测序,将所得高质量的序列（clean reads）与籼稻9311参考序列比对,获得唯一比对上某一参考基因匹配的reads（unique reads）,采用RPKM法计算基因表达量,并在此基础上以FDR≤0.001和|log₂Ratio|≥1为条件筛选出两样本间差异表达的基因,通过与Gene Ontology（GO）数据库、KEGG pathway数据库以及联合蛋白质数据库中的UniProtKB等数据库比对注释差异表达基因的功能和可能参与的分子调控途径。【结果】从水稻颖花开放前12 h和临开放前1 h 2个时间点的浆片转录组中分别检测到有26 369和26 157个表达基因,2个时间点的转录组之间存在3 924个差异表达基因,其中2 623个基因呈现下调表达和1 301个基因呈现上调表达,有105个基因表达差异倍数高达100倍以上（即|log₂Ratio|≥6.7）。GO分析结果表明被注释分子功能的差异基因有1 624个,其中21.7%基因具有离子结合活性、10.3%具有氧化还原酶活性、5.4%具有转运活性。富集于生物学过程的差异基因有1 313个,其中15.0%的差异基因参与定位、12.4%参与运输、4.7%参与碳水化合物代谢、4.5%参与脂类代谢。Pathway显著性富集分析发现有2 229个差异基因参与了123条代谢途径,其中,富集基因数目较多的途径主要包括次生物质生物合成（399个）、植物激素信号转导（152个）、核苷酸代谢（146个）以及淀粉和糖代谢（64个）等路径。花前1 h浆片中特异表达且唯一比对上基因的reads数（Uniq-reads_ num）超过30的基因的功能主要涉及细胞壁重塑、质膜的稳定性、能量代谢、基因转录调节以及信号转导等生命活动。茉莉酸及其类似物对水稻颖花开放有强烈的诱导效应,差异表达基因中有16个基因参与了茉莉酸生物合成途径以及11个基因参与了茉莉酸的信号转导过程,且随着颖花开放时间的临近,多数基因表达水平显著提高。【结论】获得颖花开放前12 h和临开放前1 h浆片中差异表达基因的表达变化模式及其功能信息,发现参与调控碳水化合物代谢与运输、细胞能量代谢、细胞壁结构修饰以及茉莉酸等激素代谢与信号转导等生理过程的基因在颖花临开前被强烈诱导或抑制表达,提示这些基因与浆片细胞吸水膨大调控水稻颖花开放密切相关。