果蔗Rar1基因反义载体的构建及遗传转化初步研究

摘要：本研究根据其它作物已克隆的RAR1基因的两个氨基酸保守位点设计简并引物，用果蔗cDNA进行PCR扩增，得到果蔗Rar1基因片段序列，推测出的氨基酸序列与其它作物推测出的氨基酸序列的CCCH结构域和一个锌结合域CHORD-Ⅱ具有很高的相似性，初步证明了所克隆的果蔗Rar1基因片段具有正确的序列信息。并构建了果蔗Rar1反义植物表达载体pCAM-RAR1，转化农杆菌后侵染果蔗的愈伤组织并得到初步验证，为转基因植物的获得以及果蔗Rar1基因功能鉴定奠定了基础。     

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。     

不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其原核表达载体构建

参照拟南芥APX基因保守域序列设计引物,扩增出不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,利用DNAman软件经序列拼接获得1个全长为1 089bp的cDNA序列,该序列包括开放阅读框867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质等电点5.52的相对分子量31 600。APX基因编码的氨基酸序列与拟南芥APX基因编码的氨基酸的同源性为81%。将APX基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白质的表达,SDS-PAGE电泳结果表明,产生了预期大小的重组蛋白。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

复叶槭FtsZ基因cDNA片段的克隆及RNA干扰载体的构建

利用简并引物RT-PCR,首次从复叶槭中克隆到569 bp的FtsZ基因cDNA片段,其与GenBank已经登录的FtsZ基因氨基酸序列的同源性为96.90%,并具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。从上述序列中选取300 bp的序列,分别克隆其正、反义基因片段,同时,克隆GUS基因的1个内含子,作为间隔区基因。将正义、间隔区和反义3个基因片段串联,插入到植物表达载体p3300-35ST中,构建复叶槭RNA干扰载体p35ST-AnFtsZi。为接下来遗传转化、培育复叶槭彩叶新品种奠定基础。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长包含完整的cDNA开放读码框732bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因,并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析

根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。     

拟南芥AtNHX1基因克隆和cre(lox)植物表达载体构建

从拟南芥叶片提取总RNA,经反转录得到cDNA。根据Genbank数据库中已登记的拟南芥Na /H 逆向转运蛋白基因AtNHX1的核苷酸序列设计并合成了1对克隆引物,通过PCR方法从cDNA中扩增出AtNHX1基因片段,将该目的片段克隆至pGEM-TEazy载体。通过酶切,从pGEM-TEazy载体上切下目的基因片段,替换pX6-GFP载体中的GFP基因,构建了AtNHX1基因cre/lox植物表达载体。     

桂果蔗1号不同级数健康种苗生长特征及性状变异

【目的】评价桂果蔗1号不同级数健康种苗的生长特征和变异特性,为提高果蔗健康种苗生产用种质量及高产栽培提供科学依据。【方法】对桂果蔗1号组培苗、第一级种茎和第二级种茎苗期生长表型性状进行连续观测,分析3个不同级数果蔗幼苗的苗数、株高、地径、叶片数及+1叶的叶长、叶宽和叶面积等7个表型性状的生长特征和变异稳定性。【结果】不同级数果蔗种苗生长特征差异明显。第一级种茎和第二级种茎各方面生长特征相近,且均显著优于组培苗（P< 0.05）,但第二级种茎各方面表现仍明显优于第一级种茎。桂果蔗1号健康种苗各性状平均变异系数为5.48%,变异幅度为3.01%～11.88%,变异幅度最大的是苗数,最小的是地径。除了第二级种茎+1叶叶宽变异幅度有所上升外,其余6项表型性状变异均伴随着级数的增加而趋向稳定。3个不同级数种源所有性状的平均变异系数为3.32%～8.25%,以组培苗的平均变异系数最大（8.25%）,第一级种茎苗次之（4.88%）,第二级种茎苗最小（3.32%）。说明组培苗性状分离最大,高级苗（第二级种茎）性状较稳定。【结论】桂果蔗1号健康种苗第二级种茎的生长特性综合表现显著优于第一级种茎和组培苗,遗传变异也较稳定,为生产栽培最佳用种。     

果蔗拔地拉种性恢复试验研究

以未脱毒果蔗拔地拉为对照,对脱毒果蔗拔地拉进行种性恢复试验,结果表明:经脱毒处理后,果蔗节间增长3.7 cm,株高增加60.1cm,单位面积产量增长33.56%,明显促进果蔗的生长,改善果蔗的产量性状。此外,还提高叶片叶绿素含量、ATP酶活性,并减少花叶病发病株率,果蔗外观品质和内在品质得到改善,种植经济效益显著提高。因此,在生产上推广应用果蔗脱毒健康种苗具有重要的意义和很大潜力。     

6个果蔗品种在龙岩市新罗区的种植表现

以龙岩龙津作物品种研究所选育的龙黑果蔗和5个福建省内果蔗地方品种为材料,采用单因素随机区组试验方法,测定6个果蔗品种的品质表现及产量,以确定适宜在龙岩市新罗区推广的品种。结果表明,龙黑果蔗产量高,茎秆直立、茎径较粗,节间较长,丰产性好,外观品质、口感等综合性状表现好,商品性好,经济效益高,适宜在当地推广种植。     

果蔗主要品种的特征特性研究初报

对 1 6个果蔗品种的特征特性进行了初步研究 ,结果表明 :大部分果蔗品种是甘蔗属热带种 (SaccharumofficinarumL .) ,其株形直立 ,蔗茎粗大 ,体细胞染色体数为 2n=80 ,叶片酯酶同工酶的变异不大 ;少部分果蔗品种是杂交选育的品种。不同果蔗品种的出苗率、分蘖率、产量及品质有较大的差异。夏植“黑皮果蔗”的有效茎数及产量与下种量之间没有明显相关性。文末介绍了若干优良果蔗品种     

果蔗Badila脱毒组培苗的光合特性

以带有花叶病果蔗badila的茎段为材料,经热处理和无处理后分别栽植于温室,以新生植株的蔗芽和心叶为材料进行组织培养,并于不同时期对不同处理的果蔗叶片进行光合特性测定.结果表明,脱毒后的果蔗Badila叶片的叶绿素含量、Pn、Gs、Tr、Fv/Fm、Fv/Fo及Yield等均高于未脱毒处理的,脱毒苗中均以愈伤苗的比茎尖苗高.因此,经过脱毒处理,有利于增加果蔗叶片的叶绿素含量,提高光合效率,促进光合作用的进行.     

蓝光与远红光诱导甘蔗开花研究续报

将难开花的果蔗（热带种）和甘蔗栽培品种置于１２．２５小时光照处理下，每天以蓝光和远红光于上午６：００－８：００和下午４：００－６：１５，在光周期室作补助光照，以代替露天的阳光。１９９１年７月１日至１２月２０日进行此种处理，结果首次在地处亚热带的福建省漳州市（北纬２４°３０＇，东经１１７°３９＇）诱导福建地方优良果蔗──同安果蔗以及甘蔗栽培品种（ＣＰ６５－３５７、赣蔗６５－５４２、闽糖８１－２３５和粤糖６５－９０６等分别于１２月上中旬开花。１９９２年６月２３日至１９９３年１月９日，又用此种方法，并经适当改进，进行处理，结果又诱导福建省另一优良地方果蔗品种──马鞍果蔗开花，同安果蔗也再次被诱导开花，福建省大面积的栽培品种闽糖７０－６１１、闽糖７０３、闽糖７６－２和闽糖８１－３３５等首次被诱导开花。     

9个果蔗品种(系)遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

【目的】对9个果蔗品种(系)进行遗传多样性分析并构建其DNA指纹图谱,为果蔗品种鉴定和分子育种等提供理论依据。【方法】利用21个SSR分子标记和毛细管电泳技术对来自4个省份的9个果蔗品种(系)进行遗传多样性分析,应用NTSYS-pc 2.11计算供试材料间遗传相似系数,并运用UPGMA法进行聚类分析,同时构建其DNA指纹图谱。【结果】21对SSR引物共扩增出204条带,多态性比例为75.99%,每对引物可扩增出4~31条带,平均为9.71条。其中,17对引物含有9个果蔗品种(系)的44个特征位点,仅有5对引物鉴别能力最强,单个引物即可将其完全区分开。选择多态性高、鉴别力强且含有品种(系)特征位点的3对引物(SMC36BUQ、SMC597CS和SMC851MS)构建了9份果蔗品种(系)基于44个位点的DNA指纹图谱。9份果蔗材料的遗传相似系数为0.62~0.90,平均为0.77。UPGMA聚类结果显示,9个果蔗材料可分为三大类群,且与材料来源地无直接关系。【结论】9个果蔗品种(系)间的遗传基础差异较小,亲缘关系较近,遗传多样性并不丰富,在育种中应加大果蔗亲本遗传背景的差异,提高其遗传多样性。     

果蔗脱毒对光合作用及产量的效应

分析了茎尖培养获得的花叶病脱毒果蔗拔地拉叶片叶绿素含量、净光合速率 (Pn)及一些叶绿素荧光参数的变化 .结果表明 ,脱毒果蔗的叶绿素含量、Pn、光合系统 原初光能转换率和潜在光化学反应活性均比感染花叶病的果蔗高 ,而且脱毒果蔗生长快 ,后期不早衰 ,蔗茎产量比未脱毒的高 30 %左右 ,品质获得显著改善     

白玉蔗组织培养研究

[目的]以广西贵港市白玉蔗为材料,探讨影响白玉蔗离体培养的主要因素,建立其快速再生繁殖体系.[方法]以白玉蔗尾梢心叶为外植体,诱导愈伤组织并进行继代培养后,分别进行不同培养基和激素组合对白玉蔗愈伤组织芽分化培养、不定芽增殖和生根壮苗等影响试验.[结果]白玉蔗心叶切片供诱导愈伤组织是方便快捷的有效方法.心叶切片接人培养基(MS+2,4-D 3 mg/L,琼脂5g/L,糖30 g/L)30 d后,外植体迅速膨胀,边缘出现颗粒状、淡黄或黄色、质地均一的胚性愈伤组织或糊状的愈伤组织.诱导白玉蔗芽分化以培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA0.2 mg/L的效果最佳;培养不定芽增殖以MS+6-BA 3.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.6 mg/L+糖30.0 g/L培养基的效果最佳.PVP和活性炭对防止组培苗褐变的效果有差异,1%活性炭能有效抑制白玉蔗增殖培养基中丛生芽的褐化.在生根壮苗培养中,最优培养基为MS+ NAA 0.6 mg/L+糖50.0 g/L+活性炭0.1%.[结论]通过正交试验设计,建立了白玉蔗的再生繁殖体系,为加快白玉蔗繁殖速度、提高繁殖系数、节约种茎提供有效途径.     

~(60)Co辐射对果蔗种芽后期生长及后代选择的影响

分别采用30、50、70Gy3种等级的60Co射线对果蔗种芽进行辐射处理,使果蔗后期生长受到不同程度的影响,表现为植株变矮、茎变细、锤度降低、丛条数变少、生势变差,并随着辐射剂量的增加,影响程度随之加大。4个果蔗品种对60Co辐射敏感性不一,罗汉蔗>白玉蜜蔗>黑皮果蔗>温岭果蔗;从辐射后代中筛选出21个单系,平均入选率为9.86%,其中以温岭果蔗30Gy辐射处理的入选率最高,达25%。