利用PMI选择标记进行杨树转基因体系的研究

[目的]利用不同于抗生素的PMI为选择标记基因的遗传转化体系,对杨树进行双抗虫基因(Bt和CpTI)的转基因研究.建立杨树以PMI为安全标记基因的转基因体系,为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验依据.[方法]选择已有的转CpTI抗虫基因(利用Km^r选择标记获得)的美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus ×euramericana ‘Nanlin895’)为受体材料,对杨树叶片、叶片分化芽、茎段生根的甘露糖敏感性等筛选优化,采用农杆菌介导的方法进行双抗虫基因的研究.[结果]较为适合的杨树叶片筛选培养基为:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1;叶片分化芽筛选培养基为:甘露糖10 g·L^-1和蔗糖20 g·L^-1;茎段生根筛选培养基:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1.在此基础上,获得了转Bt和CpTI双抗虫基因的植株8株.[结论]初步建立了以PMI为安全标记基因的杨树转基因体系:确定了PMI筛选的最适选择压,成功构建了含PMI选择标记基因的植物抗虫表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化最终获得了转双抗虫基因植株.     

胡萝卜幼苗根、茎、叶组织培养再生植株

[目的]研究胡萝卜幼苗的组织培养再生技术。[方法]以培养约2个月的胡萝卜幼苗为材料,分别取幼苗的根、茎、叶为外植体,研究不同培养基、不同外植体对愈伤组织诱导的影响,以及培养基对愈伤组织分化的影响。[结果]根、茎、叶为外植体均能产生愈伤组织,但以茎为外植体诱导的愈伤组织质量最佳,其愈伤组织的诱导率和分化率均为最高。[结论]建立了胡萝卜试管培养幼苗的愈伤组织诱导和再生植株体系,为今后的试验打下了基础。     

不同松材线虫虫株接种雪松等寄主后的组织病理学变化

用来自日本和中国的几个松材线虫虫株,分别对黑松、马尾松和雪松进行接种,接种后分离树体内的线虫,并观察树体的组织细胞变化。研究结果表明,2个日本虫株均能使黑松、马尾松和雪松发病并枯死,而中国线虫虫株仅能够使黑松和马尾松发病枯死,不能使雪松致病。接种后不同时间分离线虫,比较线虫在寄主体内的数量消长情况。发现凡接种发病死亡的,其体内线虫数量最多;发病但没有死亡的,其体内线虫数量也较多;中国虫株接种的雪松,一直没有表现任何症状,其体内也分离到了一定数量的线虫。接种后组织病理学变化表明,细胞和组织变化与线虫的移动和扩散有关。黑松和马尾松,接种日本和中国浙江松材线虫虫株后,72 h时皮层和韧皮部的薄壁细胞变形、死亡普遍存在,树脂道泌脂细胞和木射线细胞均遭到线虫破坏。144 h后,皮层、韧皮部、木质部和髓心大量细胞死亡,形成空洞,管胞中可见线虫活动。而对于雪松,接种日本松材线虫虫株后,皮层、韧皮部和形成层细胞死亡,树脂道泌脂细胞和木射线细胞死亡,有少量代谢物聚集。中国松材线虫虫株接种后,初期皮层、韧皮部细胞变形并破坏;但是,细胞的破坏只局限在小范围内。后期皮层、韧皮部细胞被破坏,但形成层完整,木射线和管胞基本完好。     

象草IT2序列的克隆与比较分析

从象草叶片提取了DNA,进行PCR扩增,获得了一段长度为283bp的IT2序列。不同物种间ITS2序列的系统发育分析表明,象草与玉米的亲缘关系最近,属于单子叶植物类群。与GenBank中其它来源的IT2序列进行比较分析,发现多条IT2序列之间存在少量碱基的差异。针对这种情况,提出可以采用“基准”IT2序列作为解决办法。     

转基因林木中安全标记基因的研究进展

近年来,林木转基因研究进展迅速。但是,由于基因工程技术中使用选择标记基因可能对生态、环境、非靶标生物等带来危害,标记基因的安全性问题已越来越受到人们的关注。据报道在基因工程研究特别是植物转基因研究中使用安全标记基因遗传转化系统方面已作了大量尝试。本文主要综述林木植物转基因研究中应用安全标记基因遗传转化系统的研究现状,重点介绍了正选择标记的使用,可重组系统去除标记基因,利用位点特异性重组去除叶绿体DNA中标记基因的叶绿体遗传转化表达载体系统,及未来基于高转化率和大量快捷PCR筛选的完全无选择标记基因的遗传转化体系等研究进展与应用前景。     

乌饭树组织培养技术

以乌饭树嫩枝作为外植体,对乌饭树组织培养技术中无菌外植体获得、不定芽产生、生根培养等步骤进行研究,以期建立乌饭树组培快繁技术。结果表明:最有效的消毒方法是用0.1%氯化汞浸泡外植体10 min。WPM基本培养基适合诱导乌饭树外植体不定芽的产生,MS基本培养基不适合诱导乌饭树外植体产生不定芽。WPM+ZT 2.0 mg·L^-1培养基上的不定芽诱导率最高,为97.7%。添加马铃薯切块的培养基明显促进了丛生不定芽的伸长,因此适合丛生不定芽伸长的培养基为WPM+ZT 1.0 mg·L^-1+马铃薯切块100 g·L^-1。已伸长的芽转移至1/2WPM+NAA 1.0 mg·L^-1+活性炭500 mg·L^-1培养基上生根效果较好,6周后可达到94.7%的生根率。     

超富硒植物壶瓶碎米荠ITS序列克隆与分析

用1对通用引物对采集自湖北省恩施市鱼塘坝独特富硒矿床土壤上的壶瓶碎米荠叶片DNA进行PCR扩增,然后对PCR扩增产物测序,获得了长度为852 bp的包含核糖体基因转录间隔区的DNA序列.将获得的多条碎米荠属不同物种的核糖体基因转录间隔区的DNA序列进行比对,拼接出"基准"序列,然后再比较不同物种核糖体基因转录间隔区的序列与"基准"序列的碱基差异.结果表明,壶瓶碎米荠与"基准"序列相比,碱基差异最多,达到17处,远远超过同属其他物种与"基准"序列的碱基差异,是平均数的3.3倍.据此推测,某种碎米荠长期生长于恩施市富硒地区,产生了能够适应高含量硒土壤逆境的遗传变异,形成了超强富硒的能力,进化出了壶瓶碎米荠这一新物种,从而提出了壶瓶碎米荠在高含量硒土壤逆境中加速进化假说.     

苹果ANR基因沉默的原因分析

检测了一个具有紫黑色果肉的苹果的ANR基因,发现了该基因被沉默。为了分析其沉默的原因,通过试验分析了该启动子序列上的顺式作用元件、内含子序列、外显子序列等的变异。结果表明,其ANR基因沉默可能是由内含子产生的变异引起,上述研究结果为今后的进一步研究打下了基础。     

拟南芥AtNHX1基因克隆和cre(lox)植物表达载体构建

从拟南芥叶片提取总RNA,经反转录得到cDNA。根据Genbank数据库中已登记的拟南芥Na /H 逆向转运蛋白基因AtNHX1的核苷酸序列设计并合成了1对克隆引物,通过PCR方法从cDNA中扩增出AtNHX1基因片段,将该目的片段克隆至pGEM-TEazy载体。通过酶切,从pGEM-TEazy载体上切下目的基因片段,替换pX6-GFP载体中的GFP基因,构建了AtNHX1基因cre/lox植物表达载体。