乳糖诱导成纤维细胞生长因子-21在大肠杆菌中的表达

[目的]研究用乳糖作为诱导剂诱导成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growth factor 21,FGF21)基因重组蛋白的表达,以探讨其工程化生产的可能性。[方法]对影响重组表达产物的乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度等进行比较,并以IPTG诱导作为对照,确定最佳的乳糖诱导条件。[结果]对于重组目的蛋白,乳糖可以起到很好的诱导效果,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。其最佳表达条件为:在A600为0.8～1.0时,加入乳糖至终浓度为0.5 g/L,在35℃下诱导6 h。[结论]乳糖可诱导FGF21基因表达,并取得良好效果,为工程化生产提供了试验数据和借鉴。     

重组鸭α-干扰素基因工程菌表达条件的研究

为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究。结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37℃培养至菌体OD600=0.8~1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30℃诱导培养4~5 h。在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响。     

不同诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)β2毒素基因的表达载体p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测了不同培养条件下,该毒素基因在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌株中的表达情况。结果表明,p ETXB2重组质粒中的β2毒素基因位于p ET-28c(+)表达盒中,且阅读框架和基因序列正确。以IPTG为诱导剂时,重组菌株BL21(DE3)(p ETXB2)的最佳培养条件为37℃,p H7.0,IPTG终浓度0.8 mmol·L-1,诱导4 h;以乳糖为诱导剂时,其最佳培养条件为37℃,p H 7.0,乳糖终浓度0.5 g·L-1,诱导5 h。     

谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸条件的优化

在不同诱导条件下,对谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸体系进行优化,确定最适诱导表达条件,为微生物发酵合成茶氨酸提供技术依据.研究结果表明:基因工程菌最佳培养温度为30 ℃,最佳诱导剂异丙基硫代-β-D半乳糖苷浓度为0.1 mmol·L-1,最佳诱导温度为28 ℃.合成茶氨酸的最适pH值为9.5,适合的缓冲液为100 mmol·L-1咪唑;反应体系中咪唑缓冲液优于磷酸钾缓冲液;低浓度L-谷氨酸钠、高浓度盐酸乙胺和高浓度三磷酸腺苷对茶氨酸的合成均有一定的促进作用,可以提高茶氨酸的生成量.     

双抗体夹心ELISA法测定猪α-干扰素的浓度

为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素(Po IFN-α)含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素浓度的双抗体夹心ELISA法(DAS-ELISA)。通过条件优化,最佳兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆纯化抗体包被浓度为12.5μg·m L-1,最佳鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作用浓度为6.25μg·m L-1,利用本实验室制备的已知浓度猪α-干扰素标准蛋白建立标准曲线,确定该方法检测猪α-干扰素浓度范围为0.0781~2.50μg·m L-1。与Lowry法、冻干称量法测定猪α-干扰素浓度相比较,3种方法检测结果无显著差异,但所建立的双抗体夹心ELISA法能够检测血清中猪α-干扰素浓度,且方法简便。     

重组Exendin-4工程菌表达体系优化

为了提高大肠杆菌中重组Exendin-4的表达量,给中试奠定基础,利用单因素试验和正交试验研究了培养基、接种量、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时长以及MgSO4浓度等对重组大肠杆菌生长和融合蛋白表达的影响.结果表明最佳培养基为2×YT,最佳接种量为3％,于细菌对数生长期中后期(OD600约1.5)开始诱导,诱导温度为34℃、乳糖浓度为0.1 g/L,于诱导9h后重组Exendin-4表达量最大.     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

生物拆分法制备D-天冬氨酸

[目的]利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶生物转化拆分DL-天冬氨酸得到D-天冬氨酸的工艺过程。[方法]研究了碳源、有机氮源、转化过程pH值和转化温度对发酵液L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活力的影响,探讨了L-天冬氨酸-β-脱羧酶的热稳定性及L-丙氨酸对L-天冬氨酸-β-脱羧酶热稳定性的影响,并测定了拆分产物的主要指标。[结果]糖类对该酶的生物合成有明显的阻遏作用,而富马酸和苹果酸是很好的碳源物质。有机氮源中蛋白胨浓度对发酵液酶活力的影响较大,当牛肉膏浓度为0.2%,玉米浆为1.0%,蛋白胨为1.0%时发酵液酶活力可以达到最高。转化过程最适pH值为6～7。转化过程最适温度50℃。温度超过60℃酶失活比较严重。浓度6.0%以上的丙氨酸能显著提高转化过程中酶的热稳定性。[结论]利用D-天冬氨酸和L-丙氨酸的等电点的差异来分离提取D-天冬氨酸的制备工艺,其工艺简单,原料价格适宜,提取方便,工艺路线要比其他方法更便捷,更容易产业化。     

黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶发酵条件优化

[目的]优化黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[方法]采用单因素试验和正交试验相结合的方法优化了黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[结果]单因素试验结果表明,以蔗糖为碳源的黑曲霉生长最好,所产酶的活力最高,最佳碳源浓度为15g/L;蛋白胨浓度为15g/L时黑曲霉干重最大,蛋白胨浓度为10g／L时所产酶的活力最高;pH值为5时黑曲霉的生物量最大,pH值为4时所产酶的活力最高;培养温度为30℃时,所产酶的活力最高。最佳培养基组成为葡萄糖20g／L＋蛋白胨5g/L＋MgSO4 0．05g/L＋KC10．5g/L＋K,HPO4 1g/L＋FeSO4 0．5g/L。当pH值为5,发酵温度为25℃,孢子接种量为10^6cfu/ml,发酵时间为96h时,培养基上黑曲霉产α-半乳糖苷酶的活力最高,达到（3．250±0．035）U／ml。[结论]该试验为仪一半乳糖苷酶的工业化生产提供了参考依据。     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

沙棘果酒苹果酸-乳酸发酵影响因素研究

以沙棘果为原料,利用酒酒球菌降酸生产全汁沙棘果酒,通过单因素正交试验确定酒精发酵的最佳条件为:pH值3.4,发酵温度25℃,接菌量8%,接种时间为酒精发酵后(顺序发酵),SO2浓度30 mg.L-1,发酵时间为8 d。苹果酸-乳酸发酵(MLF)结束后,沙棘果酒的总酸由原来的15.20 g.L-1降为9.83 g.L-1,苹果酸降解量5 422.07 mg.L-1、挥发酸增加量261 mg.L-1。在此工艺条件下酿制的沙棘果酒不仅使苹果酸大部分转化为乳酸,并且沙棘果酒的酸涩味减弱,口感得到很大的改善。     

文冠果腋芽诱导关键影响因素与培养体系优化

以文冠果幼嫩茎段作为外植体,通过对灭菌剂种类及灭菌时间、外植体采集时间、基本培养基类型、BA浓度、糖源种类和浓度等文冠果腋芽诱导的可能影响因素进行了试验研究,建立了文冠果茎段外植体高效腋芽诱导技术体系。结果表明:(1)用于外植体表面灭菌的最佳灭菌剂为0.1%HgCl2,最佳灭菌时间为4min;(2)外植体的最佳采集时间为4~5月,此阶段采集的外植体易于灭菌,成活率高;(3)腋芽诱导的最佳基本培养基为MS培养基;(4)当MS培养基中添加1.0mg·L-1 BA和0.2mg·L-1 NAA时,腋芽诱导率最高,达92.25%;(5)腋芽诱导的最佳糖源为蔗糖,最佳浓度为30g·L-1;(6)光照培养比暗培养更有利于文冠果的腋芽诱导及生长。     

‘Sorbonne’百合器官离体培养再生鳞茎的研究

通过对东方百合索蚌鳞片、鳞片叶分段诱导再生鳞茎以及鳞茎膨大的研究,建立了快繁体系。结果表明:诱导鳞片及鳞片叶产生再生鳞茎的最佳培养基都为MS+6-BA0.2(单位:mg·L-1,下同)+NAA0.2+2,4-D0.1;三种放置鳞片的方式对诱导生成的鳞茎的数量、鲜重、诱导率影响不显著;鳞片叶基部切段再生鳞茎的诱导率最高,其次为中部切段,由下向上再生鳞茎的诱导率逐渐降低;最适合诱导再生鳞茎的蔗糖浓度为30~60 g·L-1,黑暗条件下促使鳞茎膨大的蔗糖浓度以低于90 g·L-1为宜,散射光条件下促使鳞茎膨大的蔗糖浓度以低于120 g·L-1为宜。     

黄蜀葵花器官中β-半乳糖苷酶的提取纯化和酶学特性研究

目的:从黄蜀葵花中提取并初步纯化β-半乳糖苷酶。方法:以总酶活为考察指标,通过正交试验确定该酶的最佳提取条件。以酶活力和蛋白质含量为考察指标,确定盐析法的硫酸铵饱和度。以ONPG为底物,研究该酶的最适反应pH、温度及温度稳定性。结果:从黄蜀葵花中提取β-半乳糖苷酶的最佳提取条件是以3倍量(V/W)磷酸盐缓冲液4℃提取12h。以30%和70%为盐析的最佳硫酸铵饱和度。β-半乳糖苷酶在55℃总酶活性最高,热稳定性较好,70℃以上时活性迅速下降。     

马铃薯米拉试管苗壮苗、保存及试管薯的诱导

以米拉试管苗为材料,通过不同培养基的配比及温度条件,筛选出米拉试管苗壮苗、保存以及试管薯诱导的最佳条件。结果表明:米拉试管苗壮苗时,最佳条件为采用蔗糖浓度为1%、B9浓度为5 mL/L的培养基培养;保存时,温度为10℃,甘露醇浓度为20~30 g/L时为最佳保存试管苗的条件;试管薯诱导时,最佳的蔗糖浓度为10%。     

超声辅助提取大枣多糖及柱前衍生高效液相分析

为了探讨大枣多糖的超声波辅助提取最佳工艺条件及其单糖组成,研究了超声波频率、液料比、提取时间和提取温度对大枣多糖提取率的影响,以正交试验优化了超声波辅助提取的工艺条件;并采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行柱前衍生,反向高效液相色谱法(HPLC)紫外检测了单糖组分。结果表明,超声辅助提取大枣多糖的最佳工艺条件为:超声波频率28 kHz、料液比1 g∶10 mL、提取时间2.5 h、提取温度70℃,在此条件下提取率可达7.51%;提取的大枣多糖包括L-鼠李糖、D-果糖、葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等5种单糖,D-甘露糖未检出。提示本试验确定的大枣多糖最佳工艺条件可行;PMP柱前衍生HPLC分析实现了糖类物质的良好分离,可作为大枣多糖结构分析的新方法。     

农杆菌介导的木薯遗传转化体系的优化

以木薯腋芽为外植体,通过添加不同含量的2,4-D和picloram摸索诱导体细胞胚及FEC的最佳激素条件;利用优化的再生体系,以木薯脆性胚性愈伤组织(FEC)为受体,对农杆菌侵染FEC的侵染浓度、侵染时间以及侵染后潮霉素抗性筛选浓度进行了研究。结果表明,12 mg·L~(-1)的picloram能较快诱导出体细胞胚及FEC;农杆菌菌液浓度OD600=0.4并侵染30 min为FEC转化效率及植株再生率的最佳条件;共培养后,通过逐渐增加潮霉素筛选浓度(0,5,8,15 mg·L~(-1))能更有效地提高植株的再生率。     

酶解莲子工艺的研究

为了提高营养速溶莲子产品工艺技术,本研究以建宁县莲子为研究对象,采用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等多糖生物酶降解莲子得到最佳条件。研究结果表明：α-淀粉酶降解莲子的最佳条件为pH=6．5,酶用量0．0012ml／g莲子,底物浓度为5％,温度为90℃,时间为30min。葡萄糖淀粉酶糖化莲子液的最佳操作条件为pH=4．0,温度为60℃,酶量与底物量之比E／S=10000U／g莲子,底物浓度为11％,时间为11h。     

外源水杨酸与一氧化氮对玉米种子萌发及淀粉酶活性的影响

以玉米'郑单958'种子为试验材料研究外源水杨酸(salicylic acid,SA)和一氧化氮(nitric oxide,NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对玉米种子萌发及淀粉酶活性的影响.结果表明:0.1mmol·L-1 SA和不同浓度SNP(0.001、0.01、0.1、1.0mmol·L-1)均能有效促进玉米种子萌发.SA能显著提高α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性;SNP对β-淀粉酶活性有显著的促进作用,但对α-淀粉酶的作用甚微.最佳浓度SA和SNP(均为0.1mmol·L-1)共处理后其促进种子萌发的效应比单独处理更加显著,说明两者之间存在协同作用.     

兰州百合不同外植体植物组织培养

本研究分别以兰州百合鳞茎、茎、叶为外植体,探究不同激素浓度的培养基、消毒方法对兰州百合快速繁殖的影响,筛选出诱导愈伤组织及丛生芽最佳培养基、最佳消毒方法,以及不同外植体的诱导效率。诱导愈伤组织及丛生芽最佳培养基为MS培养基加6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg·L~(-1)加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3.0mg·L~(-1)加蔗糖30g·L~(-1)加琼脂8g·L~(-1);生根培养基为MS加蔗糖30g·L~(-1)加琼脂6g·L~(-1)加α-萘乙酸(NAA)0.1mg·L~(-1);最佳消毒方法为75%酒精30s加0.1%升汞12min(中间换1次升汞溶液)加无菌水冲洗5～8次;不同外植体诱导效率大小顺序为鳞茎茎叶。