新疆多浪羊白细胞介素8 cDNA的克隆测序及其变异SNP的分析

采集多浪羊的血液,分离白细胞,提取总RNA,用白细胞介素8（IL-8）的引物进行两步法的RT-PCR扩增、克隆与酶切鉴定,测序后进行序列比对,与NM_001009401.1同源性高达99%,初步判定为多浪羊的IL-8编码全长cDNA。通过序列比对,发现多浪羊IL-8的基因起始密码子上游第七个碱基发生突变,在NM_001009401.1中是T,而在测序的多浪羊的IL-8中是C。对该测序序列进行数据库搜索和序列比对,发现该碱基变异很独特,并对该变异可能对mRNA蛋白翻译的影响进行了初步的分析。     

新疆多浪羊淋巴细胞分离和培养

采集多浪羊的外周静脉血液,用人淋巴细胞分离液进行分离,收集分离得到淋巴细胞,同时经过纯化后通过镜检观察细胞形态。将纯化后的淋巴细胞在RPM I1640中置37℃,5%CO2培养箱4,6,8和12 h进行培养并观察淋巴细胞,其存活率分别为93.1%、92.4%、91.5%和90.6%。本试验成功地建立了多浪羊外周血淋巴细胞的分离技术和体外短期培养体系。     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

棉酚对多浪羊淋巴细胞凋亡的影响

通过棉酚对多浪羊淋巴细胞的研究,探索棉酚体积分数对淋巴细胞的影响.主要用细胞培养、瑞氏-吉姆萨染色、DNA电泳等方法观察棉酚对多浪羊淋巴细胞的凋亡效应.结果表明:当细胞培养液中棉酚体积分数为0.071mol/L,培养淋巴细胞8h后,可抑制多浪羊淋巴细胞的增殖,并且促进其凋亡.     

棉酚对多浪羊淋巴细胞凋亡及其对核酸降解的研究

 主要通过使用RPMI 1640培养基培养淋巴细胞、瑞氏—吉姆萨染色、DNA和RNA电泳等方法来研究棉酚对多浪羊淋巴细胞的凋亡效应和对淋巴细胞核酸影响。研究结果表明,经瑞氏—吉姆萨染色4h淋巴细胞出现凋亡小体;DNA和RNA通过琼脂糖凝胶电泳检测在4h分别出现梯状条带和18S降解。可见,当细胞培养液中棉酚浓度为1.35μmol/L,培养淋巴细胞4h后,可抑制多浪羊淋巴细胞的增殖,并且促进凋亡及其核酸的降解。     

叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA提取方法的比较

比较利用TRIZOL法和用TaKaRa的RNAiso Plus法,两种方法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA的可行性,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测及一步法RT-PCR验证,对提取所得RNA的完整性、纯度及浓度进行分析,试验结果表明:TRIZOL法获得的叶尔羌高原鳅总RNA纯度高,完整性好,可以继续进行分子克隆试验。     

新疆卡拉库尔羊TNF—α基因的克隆及核苷酸序列分析

根据普通绵羊的碱基序列和相关文献设计引物,用RT—PCR扩增并测定了卡拉库尔羊肿瘤坏死因子一仅基因的cDNA序列。结果表明,TNF-αcDNA序列包含了一个705bp的开放阅读框,通过GenBank中的Blastn序列比较分析,卡拉库尔羊的TNF-α基因与普通绵羊的同源性高达99．86％。这为将来制备卡拉库尔羊TNF-α基因探针及卡拉库尔羊分子免疫学的发展提供了理论依据。     

高致病性蓝耳病毒与低致病性蓝耳病毒RT-PCR检测方法

将高致病性蓝耳病和低致病性蓝耳病病毒接种于Marc145细胞培养并观察细胞病变情况,将有细胞病变的病毒进行连续传代培养。根据高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病在NSP2基因上有87 bp连续缺失,从NCBI上下载7对高致病性蓝耳病保守序列设计一对引物。通过RT-PCR方法进行检测证明实验室所保存的这两株毒株分别为高致病性蓝耳病和低致病性蓝耳病,并且建立了高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病的检测方法。     

多浪羊IFN-γ基因克隆及核苷酸序列分析

为了分析新疆多浪羊的IFN-γ基因,根据GenBank中NM_001009803的mRNA序列设计引物,以新疆多浪羊淋巴细胞的总RNA为模板,用RT-PCR扩增多浪羊IFN-γ基因序列。测序结果表明I,FN-γ基因序列包含了一个582 bp的开放阅读框,通过GenBank中的Blastn序列比较分析,多浪羊的IFN-γ基因与普通绵羊的同源性高达99.82%,为多浪羊IFN-γ的功能研究及多浪羊免疫应答基因的筛选奠定基础。