用PCR检测肉种鸡的鸡胚、雏鸡和子代肉鸡CAV和ALV

为了解CAV和ALV在不同阶段对肉鸡的感染情况,应用PCR方法,对山东省某3个中小型AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡和子代肉鸡中的CAV和ALV进行检测,试验直接采集样品的不同组织提取DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场及商品肉仔鸡均有这两种病毒的感染,其中CAV的阳性率24.22%;ALV的阳性率17.56%,两者共感染的阳性率8.89%。而且感染鸡各组织病毒含量也有差异,CAV以脾脏最多,ALV以肾脏最多。同时对肝脏进行细菌分离培养,并对40日龄子代商品肉鸡进行ND血凝抑制(HI)抗体效价检测,发现大肠杆菌等细菌感染阳性率较高,ND-HI抗体效价显著偏低。由此可见,鸡胚、雏鸡和子代肉鸡体内存在CAV、ALV的感染以及与细菌性疾病的共感染,造成机体免疫力下降。     

应用PCR对来源于AA肉种鸡的鸡胚、雏鸡进行CAV和ALV检测

应用PCR方法,对来源于山东省3个不同AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡中的CAV和ALV进行检测,从而了解CAV和ALV在此阶段对肉鸡的感染情况。试验直接采集样品的肝脏、胸腺、骨髓、脾脏、肾脏、法氏囊等组织提取DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场均有这两种病毒的阳性检出,其中CAV的阳性率是20.18%;ALV的阳性率13.49%,二者共感染的阳性率是6.24%。而且感染鸡各组织含量也有所差异,其中CAV以脾脏的最多,ALV以肾脏最多。同时对肝脏进行细菌分离培养时发现存在大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。由此可见,在鸡胚和雏鸡体内存在CAV、ALV的感染以及与细菌性疾病的共感染。     

3种鸡免疫抑制性疫病对禽流感疫苗免疫效果的影响

以H5N1亚型高致病性禽流感灭活疫苗,对16个规模肉鸡养殖场、11个种禽场、6个放养鸡场,按7日龄首免0.3 mL,40日龄二免0.5 mL进行注射免疫,同时开展禽网状内皮增生症病毒(REV)、白血病病毒(ALV)J亚型和传染性贫血病毒(CAV)3种免疫抑制病血清学调查。结果发现肉鸡场禽流感平均抗体滴度为5.90 log2,REV、ALV-J、CAV血清学阳性率分别为69.8%,20.1%和83.6%;种禽场禽流感平均抗体滴度为6.05 log2,REV、ALV-J、CAV血清学阳性率分别为54.3%,5.7%和82.8%;放养鸡场禽流感平均抗体滴度为6.86 log2,REV、ALV-J、CAV血清学阳性率分别为35.7%,3.6%和83.9%,表明3种免疫抑制病对禽流感抗体水平有协同抑制作用。     

病毒 REV 与 ALV-J 经鸡胚垂直传播共感染对雏鸡的协同致病性

【目的】J 亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）和禽网状内皮组织增殖病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）均可通过鸡胚垂直传播，且两者在鸡胚中的自然共感染已有报道，但两者经鸡胚共感染的致病性未有研究。建立 ALV-J 与 REV 垂直传播共感染的实验动物模型，研究 ALV-J 与 REV垂直传播共感染的致病作用及其对禽白血病净化检测的影响，以期为推动多病原协同净化提供参考。【方法】通过鸡胚接种方式构建分别携带 ALV-J、REV 及两者共感染的雏鸡感染模型，通过孵化率、死亡率、体重、胎粪 ALV-p27 抗原检出率、病毒血症阳性率等指标分析 REV 与 ALV-J 在垂直传播中共感染的致病性。【结果】ALV-J+REV 共感染组鸡胚孵化率为 65.71%，低于单感染组和空白组（CK）；共感染组死亡率高于单感染组和CK。7 日龄时 CK、ALV-J 组、REV 组、ALV-J+REV 组雏鸡平均体重分别为 59.25、50.83、49.67、43.78 g，共感染加重了对雏鸡生长的抑制。ALV 血浆病毒分离结果显示，ALV-J 组、ALV-J+REV 组阳性率在各日龄均为100%，CK 均为 0%。采集肛拭子检测 ALV-p27 抗原结果显示，ALV-J+REV 组雏鸡阳性率在 1、3、7、14 日龄分别为 91.30%、94.12%、90.90% 和 100%，肛拭子的 ALV-J p27 阳性检出率低于血浆病毒分离。比较免疫器官发育指数结果显示，ALV-J 和 REV 单感染均导致雏鸡免疫器官萎缩，共感染加重免疫器官萎缩程度。免疫器官病毒载量显示，REV 与 ALV-J 共感染促进了 ALV-J 在免疫器官中的增殖，同时 ALV-J 也促进了 REV 在免疫器官中的增殖。【结论】相对于 ALV-J 和 REV 单感染，两者共感染降低了鸡胚孵化率、增加了雏鸡死亡率、增强了对雏鸡生长的抑制作用，对诱导胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官萎缩的影响更加显著，且两者在共感染过程中对彼此复制均有促进作用。     

REV与ALV-J共感染对肉鸡T淋巴细胞免疫功能与组织病理学的影响

 【目的】研究致瘤性病毒REV、ALV-J单一感染和共感染肉鸡后血液和脾T淋巴细胞的免疫功能与脾组织病理学的变化。【方法】用一定剂量的REV和ALV-J单一感染及共感染1日龄肉鸡,取感染后不同日龄鸡的血液和脾组织,无菌分离淋巴细胞,用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测T淋巴细胞增殖活性和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性,并对脾脏进行组织切片、H.E染色检测组织病理学变化,通过免疫荧光抗体结合试验(immunofluorescence assay,IFA)分析组织病毒感染量变化。【结果】感染REV和ALV-J的肉鸡血液和脾T淋巴细胞的增值活性和CTL杀伤活性在整个感染监测期出现降低,单一感染比,共感染两种病毒的肉鸡在某些阶段出现T淋巴细胞免疫功能抑制加重;检测感染后17 d和37 d的脾脏组织病理学变化表明感染病毒的脾脏组织出现间质稀疏,淋巴细胞数量减少,生发层被破坏或减少,17 d较37 d出现病理变化更为明显;同时采用荧光标记的单克隆抗体进行IFA检测发现脾内淋巴细胞含有大量病毒粒子,在共感染两种病毒的肉鸡脾细胞内均检测出两种病毒,且含有病毒数量明显多于单一感染一种病毒的肉鸡。【结论】REV和ALV-J共感染后肉鸡T淋巴细胞功能抑制更为严重,这可能与两种病毒在肉鸡体内数量积聚增加、互为促进有重要关系;同时这两种病毒感染后造成T免疫细胞增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤活性降低,可能是病毒持续感染、增殖及组织病变、产生肿瘤细胞的前提,本研究为家禽临床生产中防治REV和ALV-J感染提供免疫学基础。     

CAV和ALV混合感染病例的诊断

本实验从10羽130日龄发病海兰白蛋鸡中分离组织病料,并进行药敏试验及PCR诊断。根据CAV、ALV已有引物,通过PCR方法检测,结果显示:样本均能扩增出584bp和1260bp的片段,即CAV和ALV均为阳性,确诊为CAV与ALV混合感染。测序结果显示,同源率分别可达97.3%～99.1%和98.3%～99.4%。     

我国部分地方鸡种禽白血病流行病学调查

[目的]了解我国地方鸡种禽白血病的自然感染状态,为今后该病的净化提供依据。[方法]采用ELISA法和病毒分离方法,对国内10个地方鸡种开展了ALV-AB和ALV-J主要外源性禽白血病流行病学调查,并进一步对其中4个品系的F_2代鸡群进行ALV跟踪监测,同时对饲养过程中使用的弱毒活疫苗也进行了ALV抽样检测。[结果]ALV-P27抗原阳性率为0~62.1%,ALV-AB抗体阳性率为0~25.0%,ALV-J抗体阳性率为0~59.0%,病毒分离阳性率为0~22.0%。4个品系的F_2代鸡群1日龄胎粪ALV-P27抗原阳性率为6.0%~67.0%,6周龄病毒分离检测阳性率为2.0%~34.3%;国内有1个厂家2个种类2个批次的疫苗分离有ALV。[结论]我国地方鸡种普遍存在ALV感染,不同地方鸡种间差异较大,可能与不同地方鸡种对ALV的遗传抗性有关;某些品系种群的F_2代雏鸡ALV阳性率甚至略有提高,可能与疫苗接种污染有关。     

地方品种皖南黄肉种鸡ALV-J与REV的共感染 及其分子变异分析

 【目的】探讨地方品种皖南黄肉种鸡群中禽白血病病毒（ALV）与禽网状内皮增生病病毒（REV）的感染状态，同时对J亚型ALV（ALV-J）分离株的囊膜糖蛋白基因（env）和非编码区3′UTR序列进行分子变异分析，并对近十年的分离株非保守序列区段进行统计比较，探讨ALV-J分子变异趋势。【方法】取7只300日龄皖南黄肿瘤病鸡分别进行病理组织学观察、IFA检测肝脏组织切片后激光共聚焦观察、细胞培养后的IFA以及PCR方法检测。【结果】7只皖南黄肉种鸡有6只同时感染ALV-J与REV，而且ALV-J和REV已经共感染同一个肝细胞。取2个ALV-J分离株进行env基因与非编码区3′UTR扩增与序列分析，两分离株的env全长均为1 704 bp，3′UTR全长均为400 bp，3′UTR区段rTM和E元件同发生双缺失；3′UTR-E元件与近十年国内来自白羽肉鸡的ALV-J分离株比较，基因缺失表现为共性，但3′UTR-rTM基因缺失呈现多样性；5′LTR作为保守序列较之前所有国内外毒株有11 bp缺失。【结论】研究发现，地方品种皖南黄肉种鸡群存在ALV-J与REV的共感染，且呈现普遍性（6/7），表明地方品种鸡高肿瘤发生率与ALV-J、REV共感染密切相关；ALV-J的基因缺失主要集中于3′UTR-E与3′UTR-rTM， 3′UTR-E元件基因缺失显示，皖南黄肉种鸡群ALV-J分离株与近十年国内来自白羽肉鸡的ALV-J分离株有共同的来源。     

江西地方品种鸡禽白血病病毒感染状况的研究

为了解江西省地方品种鸡群中禽白血病病毒的感染状况,利用针对禽白血病病毒(ALV)J亚群抗体和群特异性P27抗原的商品化ELISA检测试剂盒,对江西省12个种鸡企业的6个地方品种鸡进行禽白血病感染情况调查。结果显示江西几个地方品种鸡ALV的感染相当严重,迫切需要净化。但不同品种鸡的P27抗原的检出率与ALV-J抗体的检出率有一定差异。P27抗原阳性率最高的为JXDF4品种鸡(36.67%),其次为JXDF5、JXDF1、JXDF3、JXDF6、JXDF2品种鸡。与P27抗原检出情况类似,JXDF4、JXDF5的ALV-J抗体阳性率相对较高,分别为15%、30%,而其他4个地方品种的鸡群ALV-J抗体阳性率相对较低(10%)。调查还显示,同一品种鸡在不同种鸡场之间的ALV-J感染率差异较大。试验结果为各种鸡场开展净化工作提供了科学依据。     

血管瘤型禽白血病的实验室诊断

采用血清学方法和分子生物学技术对某蛋鸡场感染鸡进行实验室诊断,采用禽白血病A或B亚群抗体检测试剂盒对该鸡场的血清样本进行检测,抗体阳性率达到70%(7/10);针对ALV群特异性抗原P27基因进行PCR扩增,血液、肝脏病料样本中核酸的检出率分别为66.7%(4/6)、75%(3/4);取ALV 囊膜糖蛋白gp85 基因的扩增产物进行酶切分析,扩增的目的片断中存在BglⅡ和 SspⅠ酶切位点,BamHⅠ不能切割PCR 产物.试验结果证实本次疫病是由ALV-A 亚群病毒引起的血管瘤型白血病.     

鸡贫血病毒安徽分离株感染性克隆的构建及其感染特性

鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）是诱导雏鸡发生免疫抑制的重要病原之一。应用PCR方法从安徽某鸡场送检病鸡肝组织中检测并鉴定CAV,扩增病毒全基因组序列插入pcDNA3.1(+)载体,并引入含Kpn I （GGTACCCAG）酶切位点的9 bp外源性标签,获得顺次连接的双拷贝CAV基因组的重组质粒,通过脂质体介导转染鸡MDCC-MSB1淋巴细胞并拯救出CAV感染性克隆毒株。经动物试验,感染性克隆毒株在接种1日龄健康雏鸡后15 d,对胸腺等免疫器官指数影响较小,胸腺病变不明显,表明其感染能力减弱,为进一步分析CAV致病机制和筛选疫苗候选株奠定基础。     

用PCR、斑点杂交及间接免疫荧光试验诊断鸡传染性贫血的初步研究

利用地高辛标记的０８５ ｋｂ 的鸡传染性贫血病毒 （ Ｃ Ａ Ｖ） 核酸探针, 对江苏某地区疑为 Ｃ Ａ Ｖ 的１５～３０日龄病鸡的肝 Ｄ Ｎ Ａ 样品进行斑点杂交。结果在被检的２０份样品中有６份为阳性,阳性率为３０％ 。对相同样品根据已知引物（特异性扩增出 Ｃ Ａ Ｖ 的０５８ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ） 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增, 所得结果与斑点杂交相同。对应的病鸡血清经间接免疫荧光试验 （ Ｉ Ｆ Ａ）, 有７份为 Ｃ Ａ Ｖ 抗体阳性, 与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的符合率为８３％ 。初步结果表明, 江苏某地区存在 Ｃ Ａ Ｖ 感染。     

地方鸡禽白血病病毒感染调查及主要流行亚群分析

为了解湖北省地方鸡禽白血病病毒的感染状态及主要流行亚群,从麻城绿壳蛋鸡、江汉鸡、景阳鸡3个地方品种核心群采集了7 477份样品,进行蛋清p27抗原检测、公鸡病毒分离鉴定及分离株gp85基因序列分析。结果显示:3个地方鸡种蛋清p27抗原阳性率分别为1.32%、6.54%和2.82%,公鸡病毒分离率为6.11%、30.14%和8.64%,表明湖北省地方鸡禽白血病病毒感染比较严重,不同品种的感染率不同,公鸡的排毒率高于母鸡。利用PCR方法将分离的15株禽白血病病毒分为两大亚群,分离株gp85基因遗传进化分析结果显示,3个地方鸡品种主要流行J、K亚群禽白血病病毒,均存在J、K亚群禽白血病病毒的共感染,表明湖北省地方鸡禽白血病病毒感染情况较为复杂。     

VP3基因突变鸡传染性贫血病毒的构建

以含CAV标准毒CuX-1株VP3突变体的pTCAVM阳性质粒为基础,通过重叠PCR在基因组位点nt682、nt808、nt829处进行定点突变,构建pTCAVM1、pTCAVM2、pTCAVM3突变体;在此基础上,对上述3个位点进行组合定点突变,构建成功pTCAVMa、pTCAVMb、pTCAVMc突变体;此外,成功构建克隆出3个位点均发生突变的pTCAVMd突变体。所有的突变体都保证VP3定点突变位点的碱基变化,同时不引起VP2蛋白的氨基酸残基序列发生变化,保证了突变体和原始病毒抗原性的一致;将得到的突变体转染易感细胞MSB1,获得具有复制特性的病毒,将病毒接种1日龄的SPF雏鸡,发现病毒可以在鸡体内复制,并引起CAV感染的病理学变化。本研究成功获得了多株感染性克隆毒株,为研究CAV病毒致病性以及开发鸡贫血弱毒活疫苗奠定了坚实的基础。     

活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法探讨

[目的]探讨活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法.[方法]随机抽取安徽省鸡群使用的国内外活毒疫苗,使用对禽白血病病毒（ALV）群特异性p27抗原ELISA检测试剂盒进行检测,同时根据禽白血病痛毒各亚群保守的pol基因设计引物,进行PCR检测.[结果]7个国内公司鸡传染性法氏囊B87株检测结果均为阳性,某国外公司鸡痘、鸡传染性喉气管炎检测结果呈阳性,某国内公司为阳性.鸡新城疫lasota株共检测疫苗35份,检出率达28.57％.ELISA检测结果与PCR结果相一致.[结论]使用p27抗原ELISA检测试剂盒和PCR法均可作为活毒疫苗中ALV污染检测的有效方法,说明活毒疫苗中ALV污染是ALV传播的重要因素.     

鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

从安徽省合肥郊县疑似传染性法氏囊病的雏鸡体内,分离到4株病毒。经血清学、人工感染、鸡胚接种、分子生物学试验鉴定,结果表明,分离物为传染性法氏囊病病毒(IBDV)。人工感染易感鸡试验表明,4株中有2株具有超强毒株的致病特点。将其接种36日龄鸡后第2天精神沉郁,拉白色或绿色稀粪,发病率为100%。第3~4天出现死亡高峰,死亡率达80%。剖检可见全身性出血素质,法氏囊呈“紫葡萄”样外观。接种鸡胚后72~96 h引起鸡胚全部死亡。另外2株接种易感鸡后,发病率和死亡率都较低,临床症状不典型,出现亚临床传染性法氏囊病,剖检病理变化不明显,表明此2株毒力较弱。     

基于线粒体DNA D-loop区的肉鸡品种遗传多样性和起源分析

【目的】探讨不同生长速度鸡品种（配套系）线粒体DNA D-loop区全序列遗传多样性和起源特性,为肉鸡品种选育和溯源提供理论依据。【方法】以不同生长速度的8个黄羽肉鸡配套系（中快速型5个、慢速型3个）、2个地方鸡种（固始鸡、藏鸡）、2个引进鸡种（隐性白羽鸡、安卡鸡）、1个白羽肉鸡（罗斯308）、817杂交肉鸡以及1个高产蛋鸡配套系（大午褐壳蛋鸡）共计15个鸡种为研究对象,采集血液提取DNA后进行PCR扩增,对15个鸡种共683个个体mtDNA D-loop区全序列进行测序,使用DnaSP 5.10软件分析各个鸡种遗传多样性和单倍型特点,使用MEGA 4.0软件计算种间遗传距离,构建不同单倍型与红色原鸡之间NJ系统发育树,分析起源和亲缘关系。【结果】15个鸡种线粒体D-loop区全序列大小为1 231—1 232bp,序列长度为1 231 bp的个体在859 bp处存在C碱基缺失。683个个体共检测到45个变异位点,组合为53个单倍型,可以分为A、B、C和E共4个单倍型群,其中中快速型肉鸡、817杂交肉鸡以及高产蛋鸡均是E单倍型为优势单倍型（≥48.89%）;慢速型黄羽肉鸡中鸿光黑鸡优势单倍型为B单倍型,京海黄鸡优势单倍型为A单倍型,雪山鸡4种单倍型相对均衡,3个慢速型黄羽肉鸡配套系E单倍型比例≤38.46%;地方鸡种中固始鸡的单倍型为A和C型,藏鸡的单倍型为A和B型。15个鸡种单倍型多样度（Hd）分布在0.496—0.853,核苷酸多样度（Pi）分布在0.00146—0.00673,遗传多样性相对丰富的品种（配套系）是新兴矮脚黄鸡、雪山鸡、京海黄鸡和罗斯308;遗传多样性程度相对较低的品种（配套系）是藏鸡、高产蛋鸡、安卡鸡、新兴麻鸡4号和墟岗黄鸡1号。15个鸡种Kiumura双参数距离范围为0.0016—0.0113,其中罗斯308种内遗传距离最大,而817杂交肉鸡和高产蛋鸡的种内遗传距离最小;种间遗传距离最大为高产蛋鸡与藏鸡之间,最小为高产蛋鸡与817杂交肉鸡之间;中快速型黄羽肉鸡配套系相互之间遗传距离相对较小,而与慢速型黄羽肉鸡配套系以及地方鸡种之间遗传距离相对较大;京海黄鸡和鸿光黑鸡均是与藏鸡遗传距离最小。聚类分析显示,A、B单倍型群与红色原鸡滇南亚种交叉聚为一枝;E单倍型与红色原鸡印度亚种交叉聚为一枝;C单倍型群与红色原鸡印度亚种、滇南亚种、指名亚种以及印尼亚种交叉聚为一枝。【结论】不同生长速度鸡种之间线粒体D-loop区遗传多样性程度差异较大;E单倍型与肉鸡生长速度具有较强的相关性,中快速型群体均以E单倍型为优势单倍型,而慢速型群体E单倍型比例均低于40%;我国家鸡群体具有多个红色原鸡母系起源,显示其在中性选择下被驯化。研究结果为肉鸡品种选育和溯源以及资源化开发利用提供了理论依据。     

草鸡J亚群禽白血病病毒的PCR检测

通过对GenBank发表的ALV的基因序列的分析,针对J型ALV保守区设计并合成1对特异性引物。通过对反应条件的优化,确定了检测ALV的PCR检测方法,对来源于江苏地区不同草鸡养殖基地的10份病料组织样本提取DNA进行PCR扩增。结果对疑似J亚群ALV病料和正常鸡肝脏组织的病原核酸检出率分别为90%和0,同时将扩增的目的基因进行克隆测序,并与GenBank中的参考毒株进行比较,结果表明目的基因片段序列长300 bp左右,与参考毒株核苷酸序列同源性为97%以上。试验表明,江苏地区草鸡群中确实存在J亚群鸡白血病病毒感染的情况。