环介导等温扩增法对虾酱中致病菌检测结果的分析

样品按照GB4789系列标准进行增菌后,提取致病菌核酸利用环介导等温扩增技术对检测虾酱中食源性致病菌进行快速检测。结果显示:5种致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌O157检测结果阴性,符合率100%,在副溶血性弧菌中有假阳性出现。环介导等温法检测虾酱时应考虑有干扰导致假阳性出现的可能。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

副溶血性弧菌的检测研究

[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。     

银川市市售食品中单增李斯特菌污染状况分析研究

[目的]了解银川市市售食品中单增李斯特菌的污染状况及其血清型和耐药性特点。[方法]以宁夏银川市售各类生鲜食品为原料,菌株的分离鉴定按照GB4789．30—2010《单核细胞增生李斯特氏菌检验》和国家食源性疾病监测网监测方案进行;血清型检验按照血清凝集试验进行;药物敏感性试验按照K—B纸片扩散法进行。[结果]720份食品中检出单增李斯特菌45株,总检出率为6．25％,分属5个血清型,主要为1／2a型。污染率最高的是生鸡肉（8．33％）。耐药性研究表明单增李斯特菌对多粘菌素的耐受最严重,耐药率为77．78％,此外还耐受头孢噻肟、四环素、呋喃妥因、青霉素、红霉素和头孢噻吩,且出现多重耐药。[结论]银川市食品中存在不同程度的单增李斯特菌污染,生肉中单增李斯特菌检出率较高,应加强监测工作。同时存在致病性较强的血清型,呈多重耐药性趋势。     

复合探针实时荧光PCR技术快速检测海产品中 副溶血性弧菌方法的建立

副溶血性弧菌是一种食源性致病菌,海产品和其制品海鲜酱油等最容易被副溶血性弧菌污染,而副溶血性弧菌寄生于鲜虾、海鲜酱油等复杂的食品基质中有时却很难被检测出。以快速检测食品中的副溶血性弧菌为目的,针对副溶血性弧菌的tlh基因,设计引物和复合探针,采用实时荧光PCR方法检测鲜虾和海鲜酱油中的副溶血性弧菌,得出以下结论,该方法检测副溶血性弧菌具有较强的特异性和灵敏度,当鲜虾(固体)中的样品菌含量为10~3cfu·g~(-1)或海鲜酱油中的样品菌含量为10~3cfu·m L~(-1)时,无需增菌培养,即可快速检出。增菌6~8 h即可检出鲜虾(固体)或海鲜酱油(液体)的1cfu的副溶血性弧菌。     

环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

九种动物性食品致病菌通用前增菌方法的研究

为探索快速多重检测食源性致病菌的方法,对污染动物性食品的大肠埃希氏菌O157:H7(EnterohemorrhagicEscherichiacoli O157:H7),副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),创伤弧菌(Vibrio vulnificus),伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica),单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等九种致病菌进行了通用前增菌方法的研究。研究了培养基、培养温度和培养时间对九种菌前增菌效果的影响,结果表明:LB肉汤培养基,36℃培养18h,九种致病菌的增菌效果最好且数量级均衡一致,均达到108cfu·mL-1。     

科玛嘉弧菌显色培养基对创伤弧菌检测效果的研究

[目的]探讨科玛嘉弧菌显色培养基(CHROMagarTMVibrio)对创伤弧菌的检测效果。[方法]通过CHROMagarTMVibrio、梅里埃弧菌显色培养基(ChromID Vibro)与硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂培养基之间进行比对,采用阳性菌株直接平板计数和人工污染样品的方法,对CHROMagarTMVibrio的灵敏度、特异性和检测效果进行评价。[结果]CHROMagarTMVibrio平板上创伤弧菌为绿色圆形直径约2～3 mm的光滑菌落(培养24 h后)。CHROMagarTMVibrio平板在特异性上优于另2种平板,在灵敏度上跟ChromIDVibro相近,但大大优于TCBS平板。当样品中大约有3.0 cfu/ml浓度的目标菌时,经过选择性增菌培养,3种平板均可以检出。[结论]CHROMagarTMVibrio具有良好的灵敏度、特异性,能提高创伤弧菌的检出率。     

副溶血弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除

[目的]研究副溶血性弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除技术.[方法]以栽玻片模拟厨房中的玻璃类和陶瓷类厨具,选用酒精、醋酸及乳酸链球菌素作为抑菌剂对人工污染粘附到载玻片上的副溶血性弧菌进行处理,通过观察副溶血性弧菌在栽玻片上的存活数和去除率考察3种抑菌剂及其协同抑菌作用.[结果]载玻片上粘附的副溶血性弧菌的活菌数经生理盐水和不同浓度的酒精、醋酸和乳酸菌链球菌素作用后均有一定程度的降低,抑菌剂组残留的活菌数（残留率）明显低于生理盐水对照组,各抑菌组的抑菌能力均随着抑菌剂浓度的增加而增强.协同抑菌试验结果表明,pH 4.0、35％酒精、1.0 g,/L乳酸链球菌素的组合能有效抑制副溶血性弧菌在玻片上的粘附,具有良好的协同效应.[结论]副溶血性弧菌在玻璃器皿上有一定的粘附力,但酒精、醋酸和乳酸菌链球菌素具有较好的除菌效果.     

福州市售水产品中副溶血性弧菌污染状况调查

调查福州市售水产品中副溶血性弧菌的污染状况,预防由水产品引起的食源性疾病的发生,并为食品安全监管部门提供参考。随机采集360份市售水产品,按照国家标准(GB 4789.7-2013 《食品微生物学检验》)进行副溶血性弧菌的分离培养,采用全自动微生物鉴定仪VITEK 2Compact鉴定,并用多重荧光PCR方法进行毒力基因检测。360份样品中共检出115株副溶血性弧菌,阳性检出率为31.94%。其中鱼类检出率31.67%,贝类检出率42.50%,甲壳类检出率21.67%。农贸市场采集的水产品副溶血性弧菌检出率显著高于超市(P=0.0030.01,χ2=8.637)。7月份至9月份副溶血性弧菌的阳性检出率处于高峰,12月份、1月份至3月份阳性检出率处于低谷。毒力基因tlh携带率为100%,tdh携带率为29.57%。福州市售水产品都不同程度地受到副溶血性弧菌污染,建议食用时进行彻底加热烹煮,同时避免不同种类水产品间的交叉污染,降低感染的可能性。     

烟台海域鲜活海产品副溶血弧菌的污染概况及致病风险评价

为了掌握烟台海域鲜活海产品副溶血弧菌(简称VP)污染值概率分布,评估其膳食致病风险,依据GB 4789.7-2013规定方法,对分层随机采集的烟台海域7类420种鲜活海产品进行VP检测,并借助@Risk软件进行数值拟合.结果表明,烟台海域鲜活海产品VP总体污染率为23.33%,双壳类最高为26.28%,其次是头足类(25.00%)、棘皮类(25.00%)、鱼类(23.29%)、甲壳类(23.21%)、腹足类(18.75%)、海藻类(16.00%).腹足类污染值概率分布为贝塔分布、海藻类、棘皮类和双壳类指数分布,甲壳类极值分布、头足类三角分布、鱼类伽玛分布.黄、渤海海域海产品中VP总体污染率持平,VP污染值均为指数分布.第三季度水产品中VP污染率最高,各季度间比较,差异具有统计学意义(χ2=17.34,P=0.000171),第二、三、四季度VP分布分别为贝塔分布、极值分布和指数分布.鱼类的VP膳食致病风险概率值最高为1.97×10-4,其次为双壳类>头足类>甲壳类>棘皮类>腹足类>海藻类,全年的VP致病人次数均值为5.04×10-4次/人·年.说明烟台海域鲜活水产品普遍存在VP的污染,具有一定的膳食致病风险.     

副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统对其种内竞争的影响

对85株副溶血弧菌的Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system, T6SS)相关基因的携带情况进行分析,并选取部分副溶血弧菌菌株进行混合培养,探究其种内竞争情况。利用qPCR技术,分析混合培养后T6SS相关基因的表达情况。结果表明:85株副溶血弧菌均携带T6SS2,62株副溶血弧菌携带T6SS1,其中临床分离株41株,占全部临床分离株的93.2%;环境分离株21株,占全部临床分离株的51.2%,并且T6SS1基因簇在不同来源的副溶血弧菌中存在一定的差异性。在混合培养条件下,部分T6SS1~+的副溶血弧菌存在明显的种内竞争优势。基因表达分析结果显示,较单一培养的菌株,混合培养中副溶血弧菌T6SS1和T6SS2相关基因的表达量均有明显的上调。导致这一现象的原因可能是在混合培养的条件下,副溶血弧菌可通过增强自身T6SS1和T6SS2相关基因的表达,以提升其在种内的竞争力。初步探究了副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统对其种内竞争的影响,为副溶血弧菌T6SS功能的进一步揭示提供科学的参考。     

黄渤海区域贝类中副溶血弧菌污染调查及血清学分型

[目的]了解黄渤海区域零售贝类中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)污染及血清学分型情况,为指导安全消费和建立预警预报系统提供科学依据.[方法]2010年7~10月,采集山东日照、烟台、青岛、威海、大连和莱州6个城市零售市场上的贝类,利用MPN-PCR对样品进行检测和定量分析,采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析.[结果]153份样品中共检出Vp阳性115份,各城市检出率均在60.0%以上,平均为75.2%.经卡方检验显示:不同城市间的检出率无显著差异(P>0.05),不同贝类的检出率存在显著差异(P<0.05),其中螠蛏的检出率最高(100.0%).定量分析结果表明:MPN均值最高的是螠蛏(673.9 MPN/g),不同贝类中Vp的MPN平均值存在显著差异(P<0.05).血清学分型结果显示:贝类中Vp的血清型分布呈多样性,115株菌可鉴定出9个0群和53个K型.[结论]黄渤海区贝类中Vp检出率较高、分布广泛,且血清型具有多样性的特点,但未检出Vp的tdh基因.     

实时定量PCR法快速检测水产品中的副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种广泛存在于水产品中的食源性致病菌,可污染食物,引起严重的食物中毒。利用实时定量PCR方法建立一种快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法,根据随机扩增多态性分析(RAPD)鉴定特异性片段,设计特异性引物。采用建立的实时定量PCR方法检测市售水产品20份,检出阳性食品6份,最小检测灵敏度为50 fg DNA,与传统微生物检测结果相比无显著差异。该检测方法特异性强,灵敏度高。     

工厂化育苗养殖体系内细菌数量动态变化研究

[目的]探寻工厂化育苗中细菌的动态变化规律,为对虾健康养殖提供科学依据。[方法]对中国对虾育苗期养殖体系中的异养菌、弧菌、致病性副溶血弧菌进行监测。[结果]异养菌、弧菌和致病性副溶血菌数量都是对虾受精卵中高,无节幼体中最低,而后逐渐升高。在整个育苗期,对虾幼体中异养菌和养殖水体中弧菌增加1个数量级,对虾幼体中弧菌和养殖水体中异养菌均增加2个数量级。活饵中异养菌和弧菌数量很大,致病性副溶血弧菌量很低。养殖体系中幼体与水体中的异养菌和弧菌的相关系数分别为0.704和0.840;活饵中异养菌、弧菌与对虾幼体和养殖水体相关性很低或呈负相关。[结论]育苗期养殖水体与对虾幼体中细菌数量变化具有动态联系,严格控制养殖条件副溶血弧菌很难引起幼体疾病爆发,饵料中细菌数量与养殖系统中细菌数量无明显相关性。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。