SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测.     

绵羊朊病毒受体37kD/67kD LRP/LR实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

为实时相对荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体LRP/LRmRNA表达水平,构建目的基因LRP/LR、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线;根据GeneBank中绵羊37 kD/67 kDLRP/LR(LRP/LR)和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物;提取肠道组织mRNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后,与pGEM-T-easy载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α;质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定后,获得阳性LRP/LR,β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107~102梯度稀释作为模板,然后进行实时荧光定量PCR;系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示产物溶解曲线峰值单一,说明无引物二聚体及引物特异性高;LRP/LR和-βactin标准曲线相关系数分别为r2=0.999,r2=0.997,说明线性关系好;重复性试验结果显示所构建的重组质粒10次同条件扩增均Ct值具有较好的重现性,且变异率均小于5%,说明标准曲线重复性好,稳定性高。说明成功构建目的基因LRP/LR,内参基因β-actin标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体mRNA表达水...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立1种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的荧光定量PCR检测方法.[方法]用RT-PCR方法扩增TGEV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,基于SYBR Green方法以不同浓度的TGEV-N基因重组质粒作为模板进行检测TGEV的荧光定量PCR扩增.[结果]TGEV SYBR Green荧光定量PCR的扩增效率为101％,标准曲线的决定系数为0.9997,可准确检测的最低核酸模板浓度为490 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对其他3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法.[结论]建立了1种TGEV SYBR Green荧光定量PCR检测方法,可用于TGE的早期快速诊断.     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

应用实时荧光定量PCR相对定量法检测毛皮动物细小病毒载量

参考GenBank中已登录的CPV-SC-JM VP2基因序列设计引物,选用β-actin作为内参基因,利用SYBR GreenⅠ实时定量PCR相对定量法,对规模化毛皮动物场的12份粪便样品和5份血液样品进行检测。常规PCR方法检出14份,检出率82%,荧光定量PCR相对定量方法检出17份,检出率100%;粪便中病毒含量明显高于血液中病毒含量,最高可达7000倍;不同毛皮动物粪便样品中病毒含量也存在较大差异。     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为100.4%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P0.05)高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测.     

Alleviation of arsenic toxicity by phosphate is associated with its regulation of detoxification,defense, and transport gene expression in barley

Arsenic(As) contamination in soils has posed a severe threat to safe crop production. The previous studies showed the antagonism between phosphorus(P) and As in plant growth and As uptake, while the mechanisms of alleviating As toxicity by P is not completely clear. Due to the limiting P condition, it is imperative to understand how low P addition can be used to suppress arsenate As(V) uptake and the subsequent mechanisms involved. Thus in this study we investigated the effect of P addition on As uptake, anti-oxidative enzyme activity, and anti-oxidant content, and the relative expression of transport, defense, and detoxification genes using two barley genotypes differing in As toxicity tolerance. P addition significantly reduced As concentration in plant tissues, and caused the great changes in activities of catalase and superoxide dismutase, glutathione content, and the relative expression of examined genes when the plants of the two barley genotypes were exposed to 100 μmol L~(–1) As, with ZDB160(As-tolerant) being much more affected than ZDB475(As-sensitive). The current results show that P addition can alleviate As toxicity by regulating the expression of As transport, defense, and detoxification genes to a greater extent in As tolerance of barley, suggesting the possibility of controlling As uptake and toxicity by applying low amount of P fertilizers in the As-contaminated soils.     

基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体

目的COBRA对植物生长发育具有重要作用，已有的研究表明，植物COBRA基因与其次生生长有关。为探究树木COBRA基因信息及部分基因功能，我们对毛果杨PtrCOBRA基因家族展开识别和分析性研究。方法分析PtrCOBRA家族成员关系时运用系统进化树，确定毛果杨PtrCOBRA家族基因的各组织转录表达时采用半定量RT-PCR，创制PtrCOBRA3基因突变体时使用Cas9/gRNA基因编辑策略，毛果杨遗传转化采用农杆菌介导组培幼苗茎段浸染法。结果我们识别毛果杨基因组上存在14个PtrCOBRA基因成员，进化树显示PtrCOBRA家族分成两个分支。半定量RT-PCR表明，PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨木质部高丰度、特异地转录表达，在木质化茎节中其转录水平也较高。基于Cas9/gRNA技术我们敲除了毛果杨PtrCOBRA3，获得4株ptrcobra3敲除突变体。ptrcobra3突变体植株表型:植株矮小，叶片细长且卷曲，茎干略有弯曲。结论PtrCOBRA3和PtrCOBRA11是PtrCOBRA家族中与毛果杨次生生长相关的主要成员；基因敲除遗传证据显示PtrCOBRA3基因参与毛果杨茎干次生生长，PtrCOBRA11与它存在功能的冗余。      

用实时荧光定量RT-PCR方法定量绵羊PrP基因的表达

为快速、准确定量绵羊PrP基因的mRNA,建立了绵羊PrP基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法。根据已报道的绵羊PrP基因序列,设计合成引物;采用RT-PCR方法扩增目的片段;构建标准重组质粒制备标准曲线,用于样品检测。结果发现,中枢神经系统组织PrP基因的表达量(copies/ng总RNA,39420)比外周组织(为7845)的高;在中枢神经系统中,脑干的PrP基因的表达量最高(为67020);外周器官中,淋巴结PrP基因的表达量最高(为29086),肾脏的表达量最低(为125)。建立绵羊PrP基因实时荧光定量PCR方法,对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析,为进一步研究绵羊组织器官的PrP表达在传染性海绵状脑病发生中的作用提供基础数据。     

北京油鸡和来航鸡脾脏差异表达microRNA的鉴定与分析

【目的】明确北京油鸡和来航鸡脾脏重量、组织结构及其miRNA表达谱的差异,筛选与两个鸡种免疫应答能力差异相关的候选基因,为家禽抗病育种研究奠定基础。【方法】选取1日龄同期孵化的北京油鸡和来航鸡母雏各45只作为试验材料,在相同营养水平和环境条件下饲养,42日龄测量体重和脾脏重。每个品种随机选取3只个体（体重接近群体均值）,取其一半脾脏组织制作石蜡切片,利用H.E.染色,显微镜下观察脾脏组织结构、脾小体的数量和动脉周围淋巴鞘厚度。提取另一半脾脏组织中的小RNA,等量混合组成2个RNA池,构建cDNA文库,利用Solexa平台进行高通量测序。测序结果与参考基因组数据库比对获得表达基因。利用Mireap软件预测新miRNAs基因。利用RPKM（reads per kb per million reads）方法计算基因的表达量,根据FDR（false discovery rate）＜0.001和|log₂ ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因。利用TargetScan和Pictar软件预测差异表达miRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG数据库功能注释。利用DAVID软件对靶基因蛋白进行富集分析。将预测靶基因与已知脾脏重和脾脏指数相关QTL区域注解的基因取交集。【结果】在42日龄,北京油鸡的体重和脾脏重均显著高于来航鸡（P＜0.01）。组织学观察显示,两个鸡种的脾脏组织结构发育完整,可见清晰的白髓、红髓、脾小结和动脉周围淋巴细胞鞘。与来航鸡相比,北京油鸡脾小体的数量更多、动脉周围淋巴鞘更厚,鞘内淋巴细胞也更为密集。高通量测序在两组样本共鉴定出486种已知miRNA 、130个候选miRNA 和216个共表达miRNA 。两组间显著差异表达的miRNA共计35种,其中在北京油鸡中有8个表达上调,27个表达下调,它们的变化倍数在1.002-10.41之间。差异基因表达丰度在前5位的miRNA是miR-2954、miR-6606-5p、miR-146b-5p、miR-21-3p和miR-21-5p,对其2 767个靶基因的生物信息学分析结果显示,它们参与了T和B淋巴细胞的分化、免疫器官的发育、蛋白质磷酸化和细胞形态发生等生物学过程,并在泛素介导的蛋白水解、凋亡和磷脂酰肌醇信号系统等14个通路中显著富集。miR-6606-5p、miR-146b-5p的共同靶基因BLM和miR-2954的靶基因IRF8均定位于脾重或脾指数相关的QTL区域。【结论】（1）42日龄北京油鸡和来航鸡脾重、组织结构及其miRNA表达谱的确存在一些差异。（2）某些重要的差异高丰度表达miRNA(如miR-2954、miR-6606-5p、miR-146b-5p 、miR-21-3p和miR-21-5p ) 可能通过对靶基因调控,来参与调节T、B淋巴细胞分化、增殖、激活等过程,进而影响脾脏的重量、组织结构及其免疫应答能力。     

产蛋前期和产蛋期籽鹅组织内参基因的稳定性

【目的】分析比较使用广泛的7个候选内参基因在产蛋前期和产蛋期籽鹅组织中的表达情况,筛选籽鹅组织基因表达分析中最佳的内参基因及其数目。【方法】应用实时定量反转录PCR技术,分别检测28S rRNA、18S rRNA、GAPDH、ACTB、HPRT1、SDH和TUB在产蛋前期与产蛋期健康籽鹅肝脏、肾脏、心脏、腿肌和卵巢组织中的表达情况,采用绝对定量方法确定基因拷贝数,然后分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析。【结果】产蛋前期籽鹅各组织中7个内参基因表达稳定度的顺序分别为：GAPDH=HRPT1（0.195）＞TUB（0.244）＞28S rRNA（0.414）＞18S rRNA（0.495）＞ACTB（0.541）＞SDH（0.610）;产蛋期籽鹅各组织中7个内参基因表达稳定度的顺序分别为：GAPDH=28S rRNA（0.128）＞TUB（0.181）＞ACTB（0.192）＞SDH（0.221）＞HRPT1（0.316）＞18S rRNA（0.362）,且7个基因的配对差异分析分别为V2/3（产蛋前期）=0.084、V2/3（产蛋期）=0.069,内参基因的最适数目均为2个。【结论】产蛋前期和产蛋期籽鹅组织目的基因的表达分析中相对适合的内参基因分别为GAPDH和HRPT1、GAPDH和28S rRNA。     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BH21是一株对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC₅₀;利用高效液相色谱技术（HPLC）对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%-99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%-100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L^-1。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440 μg·mL^-1时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC₅₀为144.39 μg·mL^-1。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400 μg·mL^-1时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220 μg·mL^-1时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。     

分蘖相关基因在再生稻腋芽萌发期的表达分析

【目的】明确分蘖相关基因在再生稻腋芽萌发期的表达动态变化，为阐明水稻再生季腋芽发育的调控机理提供理论依据。【方法】以再生分蘖能力强的材料i21和再生分蘖能力弱的材料i89为研究对象，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测8个分蘖相关基因在水稻头季（分蘖始期和拔节孕穗期）和再生季不同时期（头季去穗后1、24、48和72 h）的表达动态变化，并分析分蘖相关基因间及其与最大再生分蘖的相关性，筛选出与腋芽生长相关性高的基因。【结果】自头季稻稻穗收割后，材料i21和i89的再生分蘖数的变化趋势基本一致，均随着腋芽的生长再生分蘖数逐渐增多，收割后20 d达最多并趋于稳定，但材料i21再生季发苗多且快，再生分蘖发生速度明显高于材料i89；材料i21和i89的最大再生分蘖数为33和10个。LAX1、LAX2和MOC1基因的相对表达量在不同材料不同时期间均存在明显差异，其中自头季去穗后，除MOC1基因在头季去穗后72 h的相对表达量外，LAX1、LAX2和MOC1基因在水稻再生分蘖形成期均表现为材料i21中的相对表达量极显著高于材料i89（P<0.01，下同），MOC1基因在头季去穗后1 h达峰值，LAX1和LAX2基因在头季去穗后24 h达峰值，随后显著降低（P<0.05，下同）并趋于稳定。头季去穗后，除TAD1基因在头季去穗后24 h时外，材料i89中D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因的相对表达量均极显著高于材料i21中的相对表达量，D10和HTD1基因在头季去穗后1 h达峰值，OsTB1和TAD1基因在头季去穗后24和48 h达峰值，D27基因在材料i21和i89中的相对表达量均先升高后降低，且头季去穗后24~72 h，D27基因在材料i21中的表达量极显著高于材料i89。最大再生分蘖数分别与LAX2和MOC1基因的表达水平呈极显著和显著正相关，与D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因的表达量呈极显著负相关。此外，不同基因的表达水平也存在不同相关性。【结论】LAX1、LAX2和MOC1基因高表达有利于水稻再生季分蘖的形成，D10、HTD1、OsTB1和TAD1基因高表达会抑制水稻再生季分蘖的形成。不同分蘖相关基因间存在相互作用，共同调控水稻再生季分蘖的形成。     

山羊早期胎儿组织TET1与Wnt通路基因的表达变化及其相关性

【目的】通过检测TET1和Wnt信号通路相关基因以及DKK家族基因在山羊胎儿发育早期的表达变化,分析TET1与Wnt通路基因的相关性,为TET1调控山羊胎儿发育研究提供理论依据。【方法】选取12只健康大足黑山羊母羊,自然发情后与同一只种公羊自然交配。采用剖腹产手术的方法,分别获得妊娠20、25、30、60和90d的胎儿,对胎儿的生长指标(体重、体长)进行统计,并采集了60和90d胎儿的组织器官样品(心、肝、肺、肾、脑、皮肤),通过Real-time PCR(RT-PCR)检测各样品中TET1基因,DKK家族基因(DKK1、DKK2、DKK3)和Wnt家族基因(Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16)的相对表达量。利用SPSS软件分析山羊胎儿发育早期不同阶段TET1与WNT信号通路相关基因相关性以及基因表达显著性(P0.05)。【结果】山羊妊娠早期胎儿生长在60d后有显著变化。荧光定量检测结果表明,TET1基因表达随妊娠天数的增加呈上升趋势。Wnt家族基因在山羊胎儿发育中都检测到表达(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)。其中,Wnt2和Wnt7b表达量随胎儿发育逐渐增高;Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d时有显著高表达(P0.05);Wnt4在胎儿发育20 d时表达显著(P0.05);Wnt16基因在妊娠25 d有显著高表达(P0.05)。DKK家族基因表达检测结果显示,DKK1在胎儿发育早期阶段都有表达,DKK2/3在妊娠初期表达量较低,后期表达增高。通过组织中基因表达检测显示,TET1在90d胎儿肝、肺、肾和脑中的表达水平相比于60d胎儿组织升高,肝中表达量显著(P0.05)。Wnt家族基因Wnt2在组织器官中有相对活跃的表达,妊娠90d胎儿肺中表达量极显著(P0.01);Wnt16基因在胎儿皮肤组织中表达显著(P0.05),且维持在一个较高的水平;Wnt5a和Wnt7b在肾中表达显著(P0.05),其他Wnt基因在组织中都有表达。相关性分析显示,胎儿生长指标(体重、体长)变化与TET1的表达呈极显著正相关(P0.01);TET1在胎儿发育早期的表达与Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈现正相关,与Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈负相关,其中与Wnt5b呈显著负相关(P0.05),与Wnt7b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt通路基因之间也有相互关系,Wnt2与Wnt4呈极显著负相关(P0.01)。Wnt2与Wnt7b,Wnt2b与Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a与Wnt5b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt4与Wnt5a呈显著正相关(P0.05)。【结论】获得了TET1与Wnt基因在山羊胎儿发育早期的表达模式,并进行了相关性分析,填补了这些基因在山羊方面的研究空白;TET1与Wnt基因对山羊胎儿早期的发育和组织的形成是一个动态的调控变化过程;TET1基因表达与部分Wnt基因呈现显著正相关,部分呈现显著负相关;Wnt通路基因之间表达量呈现一定的相关性。这些数据为TET1与Wnt分子调控山羊早期胎儿发育的机制深入研究提供了参考。     

地黄RgPR-10基因的克隆与表达

为研究地黄块根的发育机制,通过抑制消减杂交方法从地黄块根中克隆到一个多拷贝、含有完整阅读框编码154个氨基酸的RgPR-10基因(GenBank登录号为EU526395).表达分析发现地黄RgPR-10基因主要在根、茎中表达,尤其是块根中具有较高的表达量.序列分析发现该基因序列与其他物种相似性较低,可能具有不同的功能.为进一步研究该基因在地黄块根发育中的作用,对该基因进行了原核表达,并对融合蛋白进行了初步纯化,电泳检测纯化蛋白具有较高的纯度,可以用于下一步制备抗体和生化功能分析.