新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达

根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定。目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致。克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白。     

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达

【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电泳分析表明,在宿主菌JM109中成功表达了约为60ku的VP2蛋白;IPTG诱导表达时间以4.5h为宜,诱导最佳浓度为0.8mmol/L。【结论】成功克隆了IBDV BJ-10株VP2基因,并在大肠埃希菌中表达了VP2蛋白。     

兔出血症病毒VPg蛋白的原核表达及抗体制备

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。     

猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

利用RT-PCR技术从有丝分裂原刀豆素(ConA)诱导的长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因(mPolFN-γ),并将其亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-mPoIFN-γ.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAG...     

丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建

【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因(SmC4H)的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

山荆子MbLRK10L1.1基因正调控腐烂病抗性

此前从东北山荆子（Malus baccata）中发现可能参与腐烂病信号响应的WAK基因 MbLRK10L1.1，在此基础上，拟结合生物信息学分析、表达分析和功能验证研究其在腐烂病抗性中的作用机制。结果表明， MbLRK10L1.1响应Valsa mali（Vm)信号，并且在瞬时表达MbLRK10L1.1后，‘烟富6号’果实表面病斑扩散速率明显减小， FRK1（Flg22-induced Receptor-like Kinase 1）、TaNOX（Triticum aestivum NADPH oxidase）、 EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）等相关抗病基因均有不同程度的上调表达。表明 MbLRK10L1.1可通过JA、SA、SAR以及PTI等途径正调控果实对腐烂病菌的抗性。     

甜玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能分析

【目的】鉴定玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能标记在47份甜玉米骨干自交系中的多态性和对类胡萝卜素各组分含量的影响,为了解玉米类胡萝卜素合成关键基因的功能及维生素A源强化育种提供参考和依据.【方法】以47份甜玉米骨干自交系为材料,用高效液相色谱法检测籽粒乳熟期类胡萝卜素各组分的含量,合成基因PSY1、LCYE和CrtRB1的6个功能标记并在47份甜玉米自交系中检测其基因型,结合基因型和类胡萝卜素各组分的含量,检测3个关键基因的单倍型效应,并分析联合单倍型效应.【结果和结论】除CrtRB1基因的标记Indel4未检出多态性,其余标记均检测出多态性.PSY1的Indel1和Indel4组成的单倍型可解释玉米黄质和总类胡萝卜素含量表型变异的14.81%和13.00%,LCYE的5'Indel和3'Indel位点分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的15.77%、20.75%和15.92%,CrtRB1的标记3'TE未检测出显著性.基因PSY1、LCYE和CrtRB1组成的联合单倍型分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的37.20%、40.71%和41.11%.基因间联合单倍型效应高于单基因单倍型效应.PSY1和LCYE有利等位基因对甜玉米中类胡萝卜素的合成有重要影响,其功能标记可用于分子标记辅助选择,为甜玉米的维生素A源强化育种奠定了基础.     

墨兰FT同源基因的时空表达及功能分析

FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。从墨兰品种‘企剑黑墨’中克隆了新的FT同源基因,并对其各组织部位的表达特性和生物学功能进行了分析。结果表明,墨兰FT基因c DNA全长序列为618bp,其中开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、水稻中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性。墨兰FT同源基因在‘企剑黑墨’各器官中均有表达,营养生长期FT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期FT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量较高,在根和叶中的表达量最低。在拟南芥中超表达墨兰FT同源基因,能显著促进拟南芥开花。     

优质肉鸡VIP和DRD基因多态性与性成熟的关联分析

为探究鸡血管活性肠肽受体基因(VIP1和VIP2)和多巴胺受体基因(DRD1)多态性与性成熟的关系,采用PCR-SSCP和SNPs测序验证等方法对优质肉鸡F系287个个体进行了性成熟相关性状的关联分析。结果表明,VIP1基因处发现2个突变位点,分别为73352处C→T的突变,68818处T→C的突变;VIP2基因发现1个突变为36 127处A→G的突变。DRD1基因发现3个突变位点,分别为201处C→T的突变,208处A→G的突变及255处A→G的突变。与性成熟的关联性分析表明,VIP1基因73 352处的基因突变与冠高、冠长、冠重和睾丸重显著相关(P0.05),而与生长激素GH、睾酮激素TEST差异不相关(P0.05);VIP2和DRD1各处基因突变与性成熟相关指标均存在不同程度的差异显著(P0.05),但都与生长激素GH和睾酮激素TEST差异不相关(P0.05)。结果提示说明,VIP1、VIP2和DRD1基因可作为性成熟性状标记辅助选择的有效分子标记。     

海岛棉GbHCT14基因启动子克隆及上游调控因子筛选

为探究GbHCT14基因CDS区及启动子序列在棉花纤维发育中的作用,通过中国农业科学院棉花研究所数据库检索到GbHCT14基因CDS区及上游非编码区-2 000 bp片段序列,克隆CDS区及启动子,并检测启动子活性。构建cDNA文库,利用酵母单杂交技术筛选阳性克隆,获得候选转录因子,并进行生物信息学分析。结果表明:1)GbHCT14基因的CDS区全长1 144 bp,其翻译产物为亲水性稳定蛋白,预测定位在叶绿体,没有信号肽以及跨膜结构域。2)GbHCT14基因启动子预测到5个MYB结合位点参与植物苯丙烷代谢途径的调节,1个TCA-element参与水杨酸调节,6个ABA响应元件。3)GbHCT14启动子能够驱动GUS蛋白表达,具有启动活性。4)酵母单杂交初步筛选出16个候选基因,包括Gbar_D01G020710、Gbar_A09G017360、Gbar_A09G009680、Gbar_A11G003660、Gbar_A12G004430、Gbar_D04G021210、GbM_D09G1212、GbM_A11G0186、GbM_A03G0171、GbM_A09G1247、GbM_D10G0411、GbM_D10G1024、GbM_D02G1379、GbM_A11G1190、GbM_D12G0471和genome_Gbar-ZJU_D08。利用生物信息学分析预测表明,上述候选基因参与棉花纤维细胞壁的伸长、泛素化反应、细胞分裂、花发育以及果实成熟的过程,其中GbM_A09G1247与WAK2为相似基因,WAK2功能蛋白与果胶结合后促进细胞壁的伸长,而HCT家族基因则是影响果胶合成的关键因素之一。5)GbHCT14和WAK2基因在棉花开花后25 d内高表达,两者在棉花纤维发育调控存在相关性。综上,GbHCT14基因CDS区及启动子序列为首次获得,GbHCT14基因启动子具有启动活性,并且筛选到与裂合酶、转移酶、植物激素、质子泵和功能蛋白相关的16个上游调控的候选转录因子。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

转Vip3Aa基因的球孢白僵菌工程菌的构建及其对马尾松毛虫毒力的增效作用

根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa序列设计全基因扩增引物,并在引物两端添加合适的酶切位点进行PCR扩增,纯化的PCR产物和载体pbarGPE1分别经Xho I和EcoR I双酶切、连接,构建真菌表达载体pbarGPE1-vip3Aa。将构建好的质粒经Sca I酶切线性化后,利用芽生孢子转化法转入昆虫病原真菌球孢白僵菌Bb13菌株内,得到白僵菌工程菌株Bb13V。RT-PCR结果证明Vip3Aa在工程菌株中已得到成功转录。在室内恒温25℃条件下,用喂食、喷雾以及两者相结合的方法,分别测定1×105、1×106、1×107、1×108和2×108孢子.mL-1 5个不同孢子浓度下原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫的毒力。结果表明,在前4种不同浓度的处理条件下,采取3种不同的处理方式,工程菌株均比喷雾处理的原始菌株致死率提高30%以上;喷雾处理的毒力提高33.6~62.1倍;喂食处理的致死率均高于喷雾处理。在1×108孢子.mL-1浓度下,喂食处理的致死率显著高于喷雾处理,致死中时缩短6.89 d。因此,Vip3Aa基因在转入白僵菌后得到了表达,从而赋予白僵菌可观的胃毒作用,使得工程菌对松毛虫的毒力明显增强。     

苋菜AtrADH2基因克隆及表达分析

ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以'苏苋1号'苏苋2号'苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371).结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为...