不结球白菜BrABF3基因的克隆与功能分析

[目的]本文旨在研究BrABF3基因在不结球白菜开花时间调控中的功能。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,通过同源克隆获得BrABF3基因全长序列,再与其他物种中的同源序列进行进化树分析;利用注射法将农杆菌导入烟草叶片研究BrABF3基因的亚细胞定位;利用PlantCARE在线软件分析启动子motif元件;采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析BrABF3基因在早花品种‘苏州青’和晚花‘五月慢’品种不同生长期的表达情况。[结果]BrABF3基因含有1 242 bp开放阅读框,编码413个氨基酸,其蛋白定位于细胞核。在进化过程中BrABF3的氨基酸序列与甘蓝型油菜亲缘关系最近。BrABF3启动子序列中含有大量的motif元件,如光响应元件、激素响应元件和胁迫响应元件等。RT-qPCR结果表明,开花前BrABF3基因在晚花品种‘五月慢’中的表达显著高于早花品种‘苏州青’。[结论]本试验克隆并获得BrABF3基因,其蛋白定位于细胞核,而且在晚花品种中高表达,推测该基因可能参与调控不结球白菜的开花时间。     

水稻成花素分子作用机制研究进展

植物开花时间是植物适应不同自然环境的重要生物学特性.近年来模式双子叶长日植物拟南芥中的研究结果表明拟南芥的开花时间受到光周期途径、春化途径、自主途径和赤霉素途径的调节,成花素FT(FLOWERING LOCUS T)是这些调控途径最重要的整合因子之一.水稻是典型的单子叶模式短日植物,水稻中Hd3a(HEADING DATE 3a)是拟南芥FT的同源基因,它的表达产物即是水稻的成花素,可以从叶片移动到顶端分生组织,促进开花.虽然FT和Hd3a在拟南芥和水稻中的功能和序列高度保守,但通过对水稻中其它开花控制基因的研究表明,水稻Hd3a的上游调控因子和调控机制和拟南芥存在很大差异.本文对目前关于水稻成花素Hd3a及其表达调控的研究进展进行综述,为进一步研究Hd3a基因的作用机制提供参考.     

雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

拟南芥Arabidopsis thaliana中J3基因参与花期的调节,调控开花时间。为了探究竹类植物中J3基因的功能,根据植物中J同源基因的高度保守性,采用同源克隆技术从雷竹Phyllostachys vilascens中克隆出1个J3基因,命名为PvJ3。该基因的开放阅读框（ORF）区长为1 260 bp,编码419个氨基酸。通过同源比对和系统进化树分析,可知雷竹PvJ3蛋白和其他物种中J3同源蛋白的氨基酸序列同源性很高。通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,发现PvJ3基因在同一竹鞭的笋、花芽、花,开花与不开花雷竹的茎秆、成叶、幼叶中都有表达,且开花雷竹茎秆中表达量最高,表明PvJ3基因在雷竹各组织部位都有表达。亚细胞定位分析结果显示,PvJ3蛋白定位在细胞质和细胞核。通过转化拟南芥对其功能进行了初步分析,表型统计结果显示,PvJ3转基因拟南芥与野生型相比,开花时间明显提早,而且出现多主茎现象,表明PvJ3可以促使植物提前开花并且参与植物茎秆的发育。     

不结球白菜开花相关基因BcGI的克隆、亚细胞定位及基因沉默功能验证

[目的]本文旨在揭示不结球白菜GIGANTEA(GI)基因的功能,验证其与CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T(FT)基因之间的调控关系以及其在植物抽薹开花中的作用。[方法]以不结球白菜品种‘苏州青’为材料,提取RNA并反转录成cDNA,同源克隆BcGI基因,Gateway构建表达载体pEarleyGate101-BcGI-YFP,利用农杆菌介导法将表达载体注射入本氏烟草中,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。Gateway构建沉默载体BcGI-RNAi,利用农杆菌介导法将沉默载体导入拟南芥中,观察野生型和转基因植株抽薹期的表型变化。采用RT-qPCR技术,检测GI、CO、FT基因在转基因和野生型拟南芥植株抽薹期的基因表达量。[结果]通过同源克隆,得到BcGI基因,其含有1个3 516 bp的开放阅读框(ORF),编码1 171个氨基酸。亚细胞定位结果显示,BcGI定位于细胞核中。RT-qPCR结果表明,BcGI基因在沉默转基因植株中的相对表达量比野生型植株低;同时当GI基因表达受到抑制时,CO、FT基因在沉默转基因植株中的相对表达量也比野生型明显降低,沉默转基因植株与野生型相比表现为开花延迟且抽薹期莲座叶数明显增多。[结论]BcGI定位于细胞核,参与正向调控下游CO、FT基因的表达,进而影响不结球白菜光周期开花途径。     

核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因的克隆及表达分析

为了了解核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因在核桃雌雄异熟开花机制中的作用,以核桃雌先型品种‘极早丰’与雄先型品种‘新早丰’在3个时期(2月6日、3月21日及4月7日)的雌、雄花芽为试验材料,结合荧光定量PCR(qRT-PCR)、RT-PCR扩增、生物信息技术,分析了核桃JrFT基因的结构与表达,预测了JrFT基因的功能。结果表明:核桃JrFT基因在‘极早丰’与‘新早丰’3个时期的雌、雄花芽中均有表达;在不同时期同一花芽JrFT基因的表达量有所差异;在同一时期,JrFT基因在雌花中的表达量明显高于雄花,在‘新早丰’雄花中的表达量高于在‘极早丰’雄花中的表达量。克隆获得了JrFT基因的CDS序列,其长度为525 bp,编码174个氨基酸,含有高度保守的PEBP蛋白结构域。在NCBI数据库进行Blast比对显示:核桃JrFT基因与其他木本植物FT同源基因的相似性较高,可达到80%以上;JrFT蛋白与其他植物FT蛋白的相似性也很高。系统进化分析也同样说明JrFT基因属于PEBP家族基因。因此推测JrFT基因可能在核桃开花进程中具有一定的促进作用。     

核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因的克隆及表达分析

为了了解核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因在核桃雌雄异熟开花机制中的作用,以核桃雌先型品种‘极早丰’与雄先型品种‘新早丰’在3个时期(2月6日、3月21日及4月7日)的雌、雄花芽为试验材料,结合荧光定量PCR(qRT-PCR)、RT-PCR扩增、生物信息技术,分析了核桃JrFT基因的结构与表达,预测了JrFT基因的功能。结果表明:核桃JrFT基因在‘极早丰’与‘新早丰’3个时期的雌、雄花芽中均有表达;在不同时期同一花芽JrFT基因的表达量有所差异;在同一时期,JrFT基因在雌花中的表达量明显高于雄花,在‘新早丰’雄花中的表达量高于在‘极早丰’雄花中的表达量。克隆获得了JrFT基因的CDS序列,其长度为525 bp,编码174个氨基酸,含有高度保守的PEBP蛋白结构域。在NCBI数据库进行Blast比对显示:核桃JrFT基因与其他木本植物FT同源基因的相似性较高,可达到80%以上;JrFT蛋白与其他植物FT蛋白的相似性也很高。系统进化分析也同样说明JrFT基因属于PEBP家族基因。因此推测JrFT基因可能在核桃开花进程中具有一定的促进作用。     

甜樱桃PaMADS4基因克隆及其表达分析

为研究甜樱桃在高温下胚囊发育的分子机理,以甜樱桃品种‘拉宾斯’为试材,采用RT-PCR结合RACE方法克隆胚囊发育相关的MADS-box SEP类基因c DNA全长,使用半定量PCR法进行特异性表达分析,通过温室和露地环境PaMADS4实时荧光定量分析不同温度下的表达。克隆得到一个基因全长999 bp,命名为PaMADS4(Gen Bank登录号:JQ686726),包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸;序列比对和进化分析表明,PaMADS4与拟南芥SEP基因家族亲缘关系最近;组织特异性分析表明PaMADS4在四轮花器官中均表达;开花后PaMADS4在露地中的表达量明显大于温室。     

蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

鲨烯合酶基因(SQS)在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用,是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQS基因,序列全长1 489 bp,序列分析结果表明,其含有1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.58%,与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明,SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高,芽中的最低。     

金银花FT基因的克隆及在不同花器官中的表达分析

在药用植物金银花中克隆了开花整合基因LjFT(Genbank登录号：OP700454)，并对其开展了生物信息学分析和不同花器官中的表达分析。结果表明：金银花LjFT基因包含4个外显子和3个内含子，编码框长度为525 bp，编码174个氨基酸残基，其所编码的蛋白质与其他植物FT序列高度保守；基于SWISS-MODEL和Alphafold 2这2种方法进行的蛋白结构预测表明金银花LjFT与拟南芥FT在蛋白质三级结构上高度保守；启动子分析表明LjFT启动子序列中含有大量激素响应元件、光响应元件和胁迫响应元件；系统进化分析表明LjFT与绣球HmFT亲缘关系最近；表达分析表明LjFT主要在花蕾期高量表达，尤其是花萼和花瓣中，开花后表达水平迅速降低。     

水稻成花素Hd3a及其受体分子机制研究进展

成花素是有一个控制开花位点的基因FT(FLOWERING LOCUS T)编码的产物,成花素FT是植物开花途径中的关键整合因子。而水稻中的Hd3a(HEADING DATE 3a)是拟南芥FT的同源基因,Hd3a蛋白即是水稻中的成花激素,其在叶片中表达并通过微管组织运输到顶端分生组织,同成花素受体14-3-3蛋白结合,然后又附着到另一种转录因子OsFD1(FLOWERING LOCUS D)上形成成花素激活复合体,使开花基因OsMADS15功能活跃起来。文中对水稻成花素Hd3a及其受体14-3-3蛋白分子作用机制的研究进展进行了综述,为进一步研究植物开花分子生物学提供参考。     

FaesCAL基因在同型长花柱甜荞中的表达分析

为探究同型长花柱甜荞花的发育调控的分子机制，从同型长花柱甜荞中分离得到1个全长984 bp的CAL同源基因cDNA 序列，命名为FaesCAL。FaesCAL基因包含长726 bp的完整开放阅读框，编码1个由241个氨基酸残基组成的MADS-box转录因子。蛋白序列比对及系统发育分析结果表明：FaesCAL 蛋白属于MADS-box转录因子中的CAL进化系，包含1个由57个氨基酸残基组成的高度保守的 MADS 结构域和1个由68个氨基酸残基组成的次级保守区域的 K 结构域。通过实时荧光定量(qRT-PCR)检测FaesCAL基因在同型长花柱甜荞中的组织表达特异性显示:FaesCAL基因主要在根、雄蕊、花被片和5 d果实中表达，在雌蕊中表达量很低，在茎和叶片中不表达，并且在雄蕊和花被片中的表达量极显著高于其他组织（LSD， P<0.01）。进一步通过qRT-PCR检测FaesCAL基因在甜荞花芽分化5个关键时期表达量的动态变化显示：FaesCAL基因的表达量在开花前雌雄蕊成熟时表达量最高，在雄蕊花丝的迅速伸长和花被片原基的出现时期的表达量其次。推测该基因参与了甜荞的成花转变，并在雄蕊以及花被片的发育中发挥作用。     

枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析

为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

Trxf1基因表达载体的构建及在加工番茄中的遗传转化

Trxf1是硫氧还蛋白家族中的一员,是组成硫氧还蛋白系统的重要组成部分,在植物的氧化逆境中发挥作用。为进一步研究该基因功能,通过RT-PCR方法从加工番茄叶片中克隆Trxf1基因的编码区,成功构建植物表达载体pBI121-Trxf1,采用农杆菌介导法转化番茄,经PCR、RT-PCR分析表明,植物表达载体已成功整合到番茄基因组中。实时荧光定量PCR研究表明,加工番茄Trxf1基因在其根、茎、叶、花等器官中均有表达,且在叶片中表达量最高。     

两种国兰MADS-box家族B类基因PI/GLO的克隆与时空表达特性分析

为了挖掘国兰PISTILLATA/GLOBOSA（PI/GLO）基因的功能,利用生物信息学方法对两种国兰PI/GLO进行鉴定分析,并利用实时荧光定量的方法对其表达模式进行分析。结果表明,所克隆的两个 PI/GLO均为MIKC型MADS-box基因,均有保守的MADS区和相对保守的K区,且与春兰（AD158461.1）同源性较高,分别为98%、99%。两个基因的登录号为：MW654194,MW654193。RT-qPCR试验分析得出, CfPI1 在蕙兰各组织器官中的相对表达丰度顺次为：花萼>花瓣>唇瓣>花蕾>子房>盛花期花葶>合蕊柱, CsPI1 在墨兰中的相对表达丰度顺次为：花瓣>唇瓣>花蕾>花萼>合蕊柱>子房。两个基因均在盛花期的表达远远高于花蕾期和营养生长期,且主要参与花器官的生长发育。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

新疆野生樱桃李PsoRPM2与PsoLFY互作调控植株开花的分子机制

为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象，本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型，早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表达高于晚花，而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花，并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中，PsoRPM2基因表达高于晚花，同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示，PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上，新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作，提高花芽中PsoLFY和PsoFT基因表达，从而加快花芽分化进程，导致植株提前开花。