新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的eDNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD).通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-VCTD.将pGBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力:同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定pGBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性.酶切和测序结果表明,成功构建pGBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力.本研究成功构建了pGBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDVV蛋白C端纳米抗体奠定基础.     

猪传染性胃肠炎病毒 M 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.     

幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位在酵母系统中的表达

【目的】构建幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)P58亚单位酵母双杂交诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与空泡毒素P58亚单位相互作用的蛋白奠定基础。【方法】采用PCR方法,从幽门螺杆菌s1/m1型标准毒株NCT11637基因组中扩增空泡毒素P58亚单位,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后克隆入经同样酶切处理的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,构建pGBKT7-VacA P58重组质粒,并将其转化E.coliDH5α,提取质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切、测序鉴定正确后,转化入宿主酵母菌AH109,色氨酸(Trp)缺陷压力筛选,对阳性转化酵母菌扩大培养,提取总蛋白进行Western-blot鉴定,同时检测重组蛋白有无毒性、渗漏和自激活活性。【结果】成功扩增长度为1202bp的空泡毒素P58片段,重组质粒pGBKT7-VacA P58经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切可得到1202bp大小的片段,测序结果显示扩增产物序列与参考序列完全匹配。重组质粒pGBKT7-VacA P58成功地转化至酵母细胞AH109中。表达的诱饵蛋白无毒性、无渗漏及无自激活活性,Western-blot分析证实酵母菌AH109细胞正确表达了重组蛋白。【结论】成功构建了幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位酵母诱饵表达载体,其可在酵母菌系统中成功表达,且表达产物正确。     

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的，给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子，在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白，为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础，为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因，将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上，利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中，通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中，先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/...     

eSRKs酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.     

IHHNV编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活研究

应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。     

小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体的构建和自激活检测

为构建小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体,并检测其对酵母细胞的自激活作用.利用RT-PCR扩增Ta Trx-h基因的ORF区域,并与pGBKT7载体连接构建诱饵载体pGBKT7-Trx-h,利用PEG/LiAC法转化酵母AH109后,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无自激活作用.结果表明,含pGBKT7-Trx-h质粒的酵母在SD/-Trp-Leu培养基上能正常生长,说明诱饵载体表达产物对酵母细胞无毒性作用;在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上不能生长,说明诱饵质粒无自主激活报告基因的作用.因此,可以利用该诱饵载体通过酵母双杂交方法筛选与Trx-h蛋白相互作用的蛋白.     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1胞外区酵母双杂交诱饵载体构建

[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质.     

氮、磷、钾配施及其与铜、硼配施对大豆产量的影响

采用田间小区试验,研究浙春3号大立在不同的氮、磷、钾配施及其与铂或硼配施条件下产量构成因子的变化及各因子之间的相关性。结果表明,氮、磷、钾与硼或钼配施促进了大豆株高的增长,增加了大豆的百粒重、总英数和单株籽粒重,提高了大豆的产量;大豆产量与大豆植株的生物量、株高、单株籽粒重、百粒重和总英数达到显著的正相关,与经济系数及有效分枝数为负相关,氮、磷、钾与硼或钼配施主要通过大幅度提高生物学产量而最终提高籽粒产量;在试验土壤条件下,氮、磷、钾之间的配施比以2：l：l处理的大豆产量最高;氮、磷、钾对大豆产量影响大小的顺序为N＞K＞P。     

膜技术分离黄蘑多糖的工艺研究

介绍了膜技术分离、分级、纯化、浓缩黄蘑多糖的工艺;讨论了各个因素对膜分离状况的影响,并确定出较优工艺参数,得到了各级多糖的产品。     

激素间相互作用对植物茎伸长生长的调控综述

植物茎的伸长受多种内外因素的调节和控制,其中内部的内源植物激素如赤霉素、生长素等的调控起重要作用,且内源激素不但通过内源激素水平调控,而且还通过激素间的相互作用调节和控制茎的伸长。笔者介绍了各种内源植物激素(如生长素与赤霉素、生长素与油菜素内酯,赤霉素与油菜素内酯,生长素与乙烯等)之间的相互作用调控植物茎的伸长生长的研究概况。     

邻苯二甲酸酯对小麦幼苗生理指标的影响

[目的]研究邻苯二甲酸酯对小麦幼苗生理指标的影响。[方法]在不同浓度和不同时间处理条件下研究邻苯二甲酸酯对小麦幼苗叶片的可溶性糖（WSS）、叶绿素、脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量及过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性的影响。[结果]在邻苯二甲酸酯胁迫下,不同生理指标所表现出的抗性能力不同。当邻苯二甲酸酯浓度为96μg/kg时,POD、CAT活性及Pro、MDA含量都开始表现出显著抗性反应,抵抗环境胁迫;当邻苯二甲酸酯浓度为384μg/kg时,WSS含量略有下降,虽然不显著,但小麦幼苗细胞可能受到了严重伤害,并且影响到了细胞的正常生理代谢。[结论]该研究为进一步了解邻苯二甲酸酯对小麦幼苗危害的影响机制奠定了基础,为降低土壤邻苯二甲酸酯污染及保障粮食生产的安全性提供了理论依据。     

武汉市科教区冬春季PM_(10)和PM_(2.5)质量浓度及水溶性离子分析

2006～2007年冬春季在武汉市湖北大学校区连续采集气溶胶样品,并用离子色谱分析了气溶胶中水溶性无机成分的含量。结果表明,PM2.5和PM10中总水溶性无机离子年平均浓度分别为3.98和6.79μg/m3,其中4种主要的水溶性无机离子Na+、Ca2+、SO42-和NO3-,共占PM2.5和PM10总水溶性离子浓度的79%、85%。Mg2+、Ca2+、F-、SO42-、Na+和Cl-主要集中在细粒子中,NH4+和NO3-主要集中在粗粒子中。NH4+和SO24-在PM2.5和PM10中的相关系数R=0.987、0.983,主要以NH4NO3、(NH4)2SO4和NH4HSO4的方式存在。离子来源分析显示,固定排放源(燃煤)对水溶性组分的贡献要高于移动排放源(机动车)的污染贡献,而局地二次扬尘及建筑扬尘也是大气细粒子中水溶性组分的一个重要来源。     

不同配比菜粕发酵的抗营养因子脱除效果比较

设置8个不同处理的菜粕固态发酵过程,经过72 h发酵,比较不同处理发酵产物的硫苷、异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮等3种主要抗营养因子的含量,从而筛选一个最低抗营养因子含量和最高营养提升率的处理.结果表明,处理七(菜粕20 kg、菠萝汁7.5 kg、活化剂0.01 kg、菌种0.10 kg、水2.25 kg)的总脱除效果最好,硫苷、异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的脱除率分别为97.79％、100％和100％,而主要营养成分粗蛋白和小肽的含量相应提升了3.71％和195.16％.     

一氧化氮在兔球虫感染中作用的研究

通过腹腔注射的途径给予感染斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai)的家兔不同浓度的NOS底物L-精氨酸(L-Arg)和iNOS抑制剂L-氨基胍(L-AG),对球虫感染家兔诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性、血清中NO的浓度、每克粪便的球虫卵囊数(OPG)及肝的剖检和镜下病变进行了研究。结果表明:感染E.stiedai后,家兔肝匀浆的iNOS活性和血清中NO浓度逐渐升高,感染对照组、添加L-Arg组、L-AG组3组均在感染后第12 d达到最高值,而后逐渐下降,于23 d左右下降到感染前的水平;L-Arg可增强肝的iNOS活性,使其释放大量NO,产生对球虫的抑制或杀伤作用,减轻球虫感染引起的病变;而L-AG则抑制肝的iNOS活性,使生成的NO减少,对球虫的抑制作用减弱甚至消失,从而加重球虫感染引起的病变。结果提示:NO及iNOS确实参与了家兔E.stiedai的感染过程,并且NO具有一定的抑制或杀伤兔球虫的作用。     

粘帚霉生防菌株发酵液对大豆幼苗中几种防御酶活性的影响

采用盆栽试验法研究了用粘帚霉生防菌株发酵液处理后的大豆叶片组织内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果表明:3个菌株的发酵液处理大豆叶片后,4种酶的活性在大豆叶片中都有明显提高,但不同菌株发酵液处理后的酶活性提高程度不同,酶活高峰出现的时间也不同。处理后第1 d,PAL活性达到高峰,处理后第4 d,PPO活性达到最大值,处理后第5 d,SOD活性和POD活性达到高峰,说明不同的酶在大豆体内发挥作用的时间不同。粘帚霉生防菌株可通过诱导植株防御酶系活性的提高增强植株的抗病性。     

APS对感染CDV犬血常规及抗氧化能力的影响

[目的]探讨黄芪多糖（APS）对感染犬瘟热病毒（CDV）犬血常规及抗氧化能力的影响。[方法]选择45d健康、未接种犬瘟热疫苗的幼犬19只,随机分为5组,其中Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为人工染毒阳性对照组,III组为APS治疗组,IV组为APS与常规治疗结合组,V组为常规治疗组。自人工染毒当日进行治疗,连续治疗5d。各组分别于人工感染前1d及感染后第3、6天于前臂头静脉采血,进行血常规、血清SOD活性和MDA含量测定。[结果]经CDV感染后,血液中RBC、WBC、GRA、Hb含量及SOD活性均降低,MDA含量增加,均显著低于对照组（P〈0.05）。经治疗的各组中,APS和常规治疗对RBC、WBC、GRA、Hb含量及SOD活性均有不同程度的改善,但以APS和常规治疗相结合效果最明显,但与空白对照组仍存在显著差异（P〈0.05）。[结论]APS和常规治疗均可提高人工感染CDV犬的抗氧化能力,但以中西药结合效果较好。     

植物的伤卫信号分子——系统素

综述了植物体内信号分子系统素(STM)的分子结构、生物活性、生理功能及其作用机理。