15株猪流行性腹泻病毒河南株ORF3全基因的克隆与序列分析

为调查近年来河南省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,从2015—2017年河南部分地区猪场患腹泻仔猪的小肠组织及内容物中克隆了15株PEDV ORF3基因,并对其进行了序列测定及分析。结果显示,15株PEDV河南株 ORF3 基因序列长度均为675 bp。15株PEDV分离株之间核苷酸同源性为94.4％～99.9％,与经典毒株CV777、弱毒株attenuated DR13核苷酸同源性分别为95.7％～97.0％和96.6％～98.1％。遗传进化分析显示,PEDV分为两大群,3株分离株属于G1群,单独成一个小的分支。其余12株分离株与往年河南流行株、大部分国内分离株、韩国、日本、美国及法国毒株位于G2群,亲缘关系较近,而与经典毒株CV777亲缘关系较远。表明河南省PEDV有变异和进化趋势,为河南省PED的防控和疫苗的研制提供技术支持。     

猪流行性腹泻病病毒RT-PCR分子诊断及部分S基因同源性分析

2018年3月,河南焦作市某猪场发生疑似猪流行性腹泻(PED)感染,而该猪场进行过PED疫苗免疫,为确诊病原,采集患病仔猪肠管内容物,利用RT-PCR法,扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分S基因片段,并将产物送基因公司测序。所获测序结果,运用DNAStar和MEGA5软件,与GeneBank下载的不同毒株S基因片段进行同源性分析。结果显示:RT-PCR扩增产物与预期大小一致,为969bp;该毒株部分S基因与经典毒株CV777同源性为94.8%,亲缘关系较远;与近年来流行毒株同源性为98.1%～99.1%,亲缘关系较近。PEDV变异毒株的出现可能是导致免疫失败的重要原因。     

福建省猪流行性腹泻病毒检测与S基因遗传变异分析

为了解猪流行性腹泻(PED)在福建省的流行和流行毒株S基因的变异情况,对2011-2014年采自117个规模猪场的295份疑似PED的病料进行检测,对14株具有代表性的PEDV毒株进行S基因序列分析。结果显示,2011-2014年病料阳性率分别为87.30%、75.00%、40.91%和34.15%,总阳性率为69.49%,虽然PED阳性率在福建省有下降趋势,但仍较高。基因序列分析表明福建省14株PEDV分离株S基因核苷酸之间的同源性分别为98.5%~100.0%,与国内其他毒株之间的同源性为93.3%~99.5%,其中与国内2009年以前流行的PEDV毒株的同源性较低;与2008年泰国NPPED2008_2株的同源性分别为95.8%~96.1%;与CV777标准株的同源性为93.8%~94.1%。分离毒株的S基因片段氨基酸存在多个位点突变、插入和缺失现象。遗传进化树表明14株PEDV分离株与2008年泰国NPPED2008_2毒株和2009年韩国毒株亲缘关系较近,与attenuated DR13弱毒株及CV777标准株亲缘关系比较远。14株PEDV的S基因序列已登陆Genbank。     

猪流行性腹泻病毒5株安徽流行株M基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明,5株PEDV安徽流行毒株M基因的全长均为681 bp,编码226个氨基酸,核苷酸同源性为99.1%～99.9%,其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%～100%。进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。     

福建省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

为探讨福建省猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3基因遗传变异情况,于2014-2015年从福建省不同地区猪场扩增8株PEDV的ORF3基因,并进行序列比对及遗传进化分析。结果表明:8株分离株均为野毒株;与近年来国内及其周边国家的分离株亲缘关系较近,其核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性最高高达100%;与经典株CV777亲缘关系较远,其核苷酸及推导的氨基酸同源性达96.0%~96.9%与92.5%~94.7%;表明近年来福建省PEDV流行株较以往的经典株已经发生了改变。     

猪流行性腹泻病毒E和M基因的克隆及变异分析

为了解2012-2014年福建省流行PEDV毒株E和M基因的变异情况,对19株PEDV的E基因和18株PEDV的M基因进行克隆和序列分析。结果表明:与CV777标准毒株相比较,福建流行PEDV毒株的E和M基因存在编码的部分氨基酸变异。19株PEDV E基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.4%~100.0%和97.0%~99.6%。18株PEDV M基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.2%~99.6%和97.5%~98.4%。核苷酸遗传进化树表明福建流行PEDV毒株的E基因与CV777亲缘关系较近,而M基因与2008年泰国流行的KU05CB08毒株亲缘关系较近,是个新的基因型,可能源于泰国。     

2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV S基因型分析

2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV S基因N端序列的RT PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV S1基因型变异情况。临床检测结果表明：　PEDV临床检出率由2010年的4286%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。 PEDV S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。     

猪流行性腹泻病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero细胞的传代适应性研究

为了解PEDV YL112株与其他不同来源PEDV毒株之间在分子生物学上的差异,对PEDV YL112株的M基因进行了扩增和序列分析。结果表明:PEDV YL112株与参考株的M基因核苷酸同源性在97.9%~99.8%之间,显示出高度保守性。系统进化树分析表明,PEDV YL112株与经典株CV777的亲缘关系较远,而与我国地方流行毒株HLJBY分离株以及HN-XYYYP-2007的亲缘关系较近。为进一步了解该毒株的复制特征,采用Vero细胞对PEDV YL112株进行体外细胞传代适应性研究。结果表明:经过连续传代培养后,PEDV YL112株对Vero细胞的适应性显著增强,其滴度从第5代的104.8 TCID50/0.1m L提高至第40代的10~(7.6) TCID_(50)/0.1m L。本研究对于分析PEDV的遗传变异规律、了解病毒的致病特征及开发新型疫苗等均具有重要理论和现实意义。     

闽西地区猪流行性腹泻病毒M基因遗传进化及分子结构特征分析

为了解2015—2017年闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传进化规律,本研究收集了闽西地区12份PEDV阳性样品,对其M基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果表明,12株闽西毒株M基因氨基酸序列同源性为100.0%;遗传进化分析表明,12株闽西毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株LCZ、以及韩国毒株SM98、virulent DR13的亲缘性较远,而与2010年后国内分离毒株以及2013年美国分离毒株亲缘关系最近,说明闽西PEDV毒株属于目前国内外流行毒株。分子结构特征分析表明,PEDV M基因具备高度保守的特性,可以作为设计疫苗的候选基因。     

3株猪流行性腹泻病毒M基因克隆与序列分析

【目的】了解近年来京津冀地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株M基因的变异情况。【方法】用RT-PCR技术从京津冀地区部分仔猪腹泻样品中扩增与克隆3株PEDV流行株M基因全长序列,并进行序列测定和分析。【结果】基因序列结果显示,3株PEDV的M基因全长均为681nt,其核苷酸同源性达99.7%以上,在系统发育进化方面属于同一簇。M基因系统发育进化关系显示,虽然这3株PEDV与中国以前PEDV流行毒株及疫苗株CV777属于不同的簇,但其与国内外其他PEDV参考毒株的核苷酸同源性均达96.5%以上。【结论】M基因仍然是检测PEDV的良好目的基因。     

中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展

2010—2011年中国境内的猪流行性腹泻（PED）大流行给养猪业造成重大经济损失。因疫苗免疫无法控制疫病流行,因此学者普遍认为猪流行性腹泻病毒（PEDV）出现了新的变种。论文综合分析了这个时期国内学者PEDV分子流行病学的研究结果,又对国内新近分离的PEDV的11个毒株的全基因序列进行遗传进化分析,进一步确定了国内暴发流行的PEDV毒株已远离中国86年分离的毒株和欧洲毒株CV777,成为了一个新的基因型。毒株基因变异应该是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。进一步分析发现分离毒株的全长基因序列和棘突蛋白（S）基因序列长度有差异,其他基因长度保守性强。S基因的变异率高于其他基因,特别是短期内基因突变主要发生于S基因。综合分析认为国内变异毒株虽与韩国毒株遗传关系较近,但从境内毒株衍生和进化而来的可能性更大。因2006年已经观察到PEDV的免疫失效和PED流行,2010—2011年PED集中暴发可能是病原长期突变和适应性积累的结果,提示今后应充分发挥全国动物疫病预警网络的作用,加强毒株进化检测和疫病预警,优化疫病的防控手段,降低疫病发生频次和规模,减小疫病发生损失。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及N基因序列分析

[目的]了解引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒是否为变异株.[方法]从疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场采集死亡仔猪的肠黏膜及其内容物,将病料常规处理后接种VERO细胞,采用维持培养液加10 μg/mL的胰酶的方法分离培养.用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归实验以及部分序列分析等方法对分离株进行鉴定.[结果]病料在接入细胞第一代即出现病变,细胞肿胀变圆,形成合胞体,逐渐脱落,细胞病变明显.随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐稳定,进行RT-PCR检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验,最终确定分离株符合PEDV特征,并命名为BJ2015,测定毒株的TCID50为10-6.4/0.1 mL.基因测序结果显示,N基因长1 329 bp,编码442个氨基酸.与参考株N基因核苷酸序列比对及遗传进化分析表明,BJ2015与传统株CV777亲缘关系较远;与流行变异株BJ-2011-1N基因在进化树的同一个分支上,二者的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％、99.5％,表明BJ2015与BJ-2011-1亲缘关系较近.[结论]结果表明BJ2015为PEDV流行性变异毒株.     

2016—2018年四川地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查与ORF3、S1部分基因序列分析

为分析四川地区猪流行性腹泻流行状况及分子遗传演化特征,对2016年6月至2018年6月收集的71份猪腹泻病例进行RT-PCR检测与相关的流行病学调查,并对其中4份阳性样品进行ORF3、S1基因的检测与序列分析。结果显示,近2年的发病高峰日分别在1月28日和2月11日,发病高峰期在12月至3月;猪场连年感染数量下降,新疫源地增加;ORF3基因可分为2个基因型,部分毒株发生少量碱基突变;从S1基因高变区段分型结果显示,2016年底至2018年初流行的PEDV毒株为GⅡ群,与目前流行的PEDV变异毒株在同一分支,同源性为92.8%~99.3%,碱基变异数量较大,与国内的经典疫苗株CV777亲缘关系较远,同源性为82.7%~87.3%,发病时期更集中,较传统PEDV有轻度后移。结果表明,四川地区规模化猪场PED发病率呈下降趋势,对于该病的防控取得初步成效。目前流行PEDV毒株有变异的趋势,为PEDV的防控奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其 M、N和E基因的序列分析

对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。     

2014-2017年中国部分地区PEDV流行株S基因遗传进化分析

参考GenBank中PEDV经典CV777毒株基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法对临床采集的疑似PEDV样品进行S基因扩增、克隆和测序,拼接获得30条完整S基因序列,并进行遗传进化及同源性分析。结果显示,获得的30条PEDV S基因与25个参考株S基因的核苷酸相似性介于93.6%～99.8%;且各流行毒株与经典毒株比较,具有多处的点突变、插入和缺失。与其他参考株相比,S1区存在157个氨基酸突变位点,占总数的65.7%（157/239）,暗示PEDV的 S1区域比S2区域易发生变异;表明目前中国PEDV流行株已经发生了变异,在一定程度揭示了免疫猪群仍然发病的原因。     

Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV) HLJ Strain with IPEC-J2 Cells and Phylogenetic Analysis of Its S Gene

Porcine epidemic diarrhea(PED) is caused by porcine epidemic diarrhea virus(PEDV), and is characterized by vomiting, diarrhea and dehydration of suckling pigs from 80% to 100% morbidity and 50% to 90% mortality, and resulted in tremendous economic losses to swine industry.The PEDV mainly infects small intestine of pigs, resulting in vacuolar degeneration and necrosis of mucosal epithelium.The IPEC-J2 is a pig intestine epithelial cell line, which is similar to the intestinal environment of piglets, can be used to isolate and identify the PEDV field isolates.In this study, it appeared the PEDV typical postmortem changes and histopathological lesion of degeneration and destruction of small intestine in infected piglets, and IHC identified that the PEDV distributed in the mucosa and submucosa of small intestine mostly.Furthermore, the PEDV HLJ strain was successfully isolated and characterized in the IPEC-J2 cells, and indicated that the IPEC-J2 cell line was sensitive to isolate and adapt the PEDV field strain, and could be utilized to multiply the PEDV rapidly.The S gene analysis indicated that the PEDV HLJ strain was the prevailed virus, belonged to Group 1 with attenuated virulent DR13, SC1402 and J-S2/2015 strains isolated in South Korea and China from 2014 to 2015.This study had important theoretical and practical significances on analyzing genetic variation of the PEDV, understanding the pathogenic characteristics of the virus and developing new vaccines for the PED.