猪圆环病毒2型/3型双重荧光定量PCR检测方法

为了能够同时快速地检测和鉴别猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3),参考GenBank中已发表的PCV2和PCV3基因组序列,针对其保守区分别设计了2对特异性引物,经优化反应体系和条件,建立了能快速检测和鉴别PCV2/PCV3双重荧光定量PCR方法.结果 表明,PCV2和PCV3的R2分别为0.999、0.9993,E值分别为3.5731、3.3734.该方法能同时特异地检测PCV2和PCV3,而对其他5种猪病原均未检测到荧光信号;PCV2和PCV3的最低检测值分别为41.1 copies·μL-1、27.0 copies·μL-1;批内和批间变异系数均小于1％.临床样本检测结果显示,PCV2和PCV3的阳性率分别为62.12％(41/66)、48.48％(32/66),二者混合感染的阳性率为46.96％(31/66).表明该方法具有敏感、特异和可靠等特点,该方法为PCV2和PCV3单独或者混合感染的早期诊断、定量检测及其流行病学调查提供了可行的技术支持.     

河南地区猪流行性腹泻病毒S基因和ORF3基因分子特征和遗传进化分析

为了分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)近年在河南省的流行情况,本研究于2014年1月至2015年12月收集河南省不同地区的200份PED疑似病料进行S基因和ORF3基因检测,通过RT-PCR扩增、克隆测序及序列分析,显示15株河南流行株S基因和ORF3基因的部分氨基酸和核苷酸不同于参考株,发生了变异。其中15个毒株的S基因和ORF3基因变化显示,PEDV河南毒株和其他参考株均可分为两个群,基于S基因扩增的15株则独立成群,与其他参考毒株亲缘较远;基于ORF3基因扩增的15个毒株与国内分离株、美国株及韩国株均有较近的亲缘关系;同时,对于S基因和ORF3基因在整个进化关系中,本试验中的15个河南株均相对独立成群,与经典毒株CV777及国内所使用的疫苗株,亲缘关系较远。结果表明,PEDV有变异和进化的趋势,应从当前流行毒株中选用有效的疫苗才能更好地控制本病的发生。     

猪伪狂犬病疫苗的研究进展

猪伪狂犬病是由猪疱疹病毒I引起的一种急性高度接触性传染病,可造成不同阶段的猪发病,且一旦发病很难根除,给养猪业造成了严重的经济损失。目前,疫苗免疫接种是预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一。早期的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗。随着生物学技术的发展,PR基因缺失疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和重组疫苗等新型疫苗也随之诞生。本文对猪伪狂犬病疫苗的研究作一综述,为该病的有效防控提供了有益参考。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法。本研究根据GenBank中登录的PEDV和PCV3基因组序列,分别在M基因和Rep基因高度同源保守区设计2对特异性引物,建立了检测PEDV和PCV3双重PCR方法,即可同时扩增225bp(PEDV)和138bp(PCV3)2条特异性片段,而该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌核酸扩增均为阴性;PEDV和PCV3的最低检出量分别为428和325拷贝/μL,且特异性强、敏感性好,为快速、高效检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

河南地区猪圆环病毒3型的PCR检测

为调查河南地区猪圆环病毒3型(PCV3)的感染情况及流行特点,对2015—2017年河南不同地区猪场采集的152份临床样品进行PCR检测PCV3。结果显示,152份临床样品中检测到46份PCV3,阳性率为30.26%(46/152),在开封、新乡、鹤壁等7个地市均检测出PCV3,说明PCV3在河南省部分地区存在并且已呈现流行趋势;152份临床样品中有105份样品PCV2为阳性,阳性率为69.08%,且所有PCV3阳性样品均可检测出PCV2,推测PCV3与PCV2的共感染可能广泛存在。本研究对河南省猪圆环病毒病的防控提供基础信息。     

猪流行性腹泻病毒中和表位区S1D的原核表达及免疫原性分析

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白中和表位区S1D的免疫原性,根据PEDV河南株(Gen Bank:YK649107)S1基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增S1D片段,克隆到p ET-28a(+)中,构建原核表达载体,经优化的IPTG浓度诱导后进行SDS-PAGE分析,利用His标签的特性重组蛋白进行纯化及Western blot分析。结果显示:中和表位S1D片段在p ET-28a(+)中高效表达;Western blot证明重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性反应;用纯化的蛋白免疫新西兰白兔,抗体水平升高,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

猪PBD1成熟肽基因在干酪乳酸杆菌中的表达及其抑菌活性的检测

为获得一株能够稳定表达猪β防御素-1 (PBD1)成熟肽蛋白的重组干酪乳酸杆菌,本研究将PBD1成熟肽基因克隆至含有短小干酪乳酸杆菌信号肽的pUCK-SP载体中,再将SP-PBD1亚克隆到干酪乳酸杆菌整合性表达质粒pMJ67的Lac启动子下游,获得重组质粒pMJ67-SP-PBD1,电转化入干酪乳酸杆菌,经红霉素抗性筛选和基因组DNA PCR测序鉴定,证实猪PBD1基因整合到了干酪乳酸杆菌中。采用半定量RT-PCR分析显示,经2%乳糖诱导18 h后的重组菌中猪PBD1 mRNA含量最高。Western blot检测显示,经乳糖诱导的重组菌表达了约5.8 ku的目的蛋白,与PBD1成熟蛋白理论分子量相符。抑菌试验结果显示重组PBD1对葡萄球菌具有明显抑制作用。表明猪PBD1基因在重组干酪乳酸杆菌中获得了表达,且具有抑菌活性。本研究为进一步研发具有广谱抗菌作用的微生态制剂奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

2014-2017年中国部分地区PEDV流行株S基因遗传进化分析

参考GenBank中PEDV经典CV777毒株基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法对临床采集的疑似PEDV样品进行S基因扩增、克隆和测序,拼接获得30条完整S基因序列,并进行遗传进化及同源性分析。结果显示,获得的30条PEDV S基因与25个参考株S基因的核苷酸相似性介于93.6%～99.8%;且各流行毒株与经典毒株比较,具有多处的点突变、插入和缺失。与其他参考株相比,S1区存在157个氨基酸突变位点,占总数的65.7%（157/239）,暗示PEDV的 S1区域比S2区域易发生变异;表明目前中国PEDV流行株已经发生了变异,在一定程度揭示了免疫猪群仍然发病的原因。