猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立

根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因序列和猪博卡病毒(PBoV)不同基因型VP1基因序列,设计2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PBoV3/4/5型VP1基因,回收扩增产物分别克隆入pMD~18-T载体,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的模板,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PBoV3/4/5型的二重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法线性关系良好,能特异、敏感性检测PEDV与PBoV3/4/5型;对PEDV与PBoV3/4/5型的最低检测极限分别为72.6copies/μL和76.9copies/μL,为常规PCR方法的100～1 000倍;本研究建立的PEDV和PBoV3/4/5型荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

猪博卡病毒G1基因群和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时快速定量检测猪博卡病毒(PBoV)G1基因群和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究参照GenBank登录的PBoV的NP1基因和PEDV的M基因保守序列,设计了引物和探针,经优化反应条件后,建立了能够同时检测PBoVG1基因群和PEDV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示该方法与PCV2、PRV、PDCoV、PRoV和TGEV无交叉反应,敏感性试验结果显示该方法对PBoV、PEDV的质粒标准品检测下限分别为21.8拷贝/μL和31.7拷贝/μL;且组内、组间变异系数均小于4%,重复性好。应用本实验建立的方法对2017年5月~2018年8月,河北省部分地区采集的142份仔猪腹泻样品检测结果显示,PBoVG1阳性率为18.3%(26/142),PEDV阳性率为62.7%(89/142),其中PBoVG1与PEDV共感染率为10.6%(15/142),该方法优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对PBoV和PEDV的准确检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要意义。     

鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株双重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株的检测方法,本研究根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M、ORF3基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PEDV野毒株和疫苗株的双重RT-PCR检测方法。特异性试验显示,该检测方法对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、Salmonella及E.coli等结果均为阴性;敏感性试验显示,所建立的双重PCR检测方法对M基因和ORF3基因的最低有效检测量分别为44.5拷贝/μL和481拷贝/μL。本研究建立的双重RT-PCR检测方法可实现对PEDV野毒和疫苗毒的快速检测,适合于现地猪流行性腹泻的鉴别诊断。     

猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的检测

为了检测猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的情况,研究建立了快速,简便,灵敏度高,特异性强的鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪博卡病毒(PBoV)的双重检测方法。针对PRV gE基因和PBoV NS1基因的序列,分别设计了2对特异性引物,通过对引物浓度、模板加入量、退火温度等的优化,建立了快速鉴别PRV和PBoV的双重PCR检测方法,并进行了特异性和敏感性试验。特异性试验表明,该方法可以扩增出PRV gE长度为316 bp和PBoV NS1长度为996 bp的目的片段,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪捷申病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无扩增;敏感性试验表明,PRV、PBoV的最低核酸检出量分别为6.44×10~2拷贝和9.51×10~3拷贝,与单一PCR敏感性相同。应用该方法对49份送检病料样品进行检测,其中PRV和PBoV的单纯感染检出率分别为34.69%和14.28%,混合感染检出率为8.16%,与单一PCR检测结果符合率为93.88%。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能够检测猪博卡病毒(PBoV)所有基因型的检测方法,本研究根据PBoV每个基因群(G1、G2和G3)的保守区域设计特异性引物,建立了检测PB V的PCR方法。特异性试验结果显示除PBoV外,其它猪病病原核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性;对pMD-GD6、pMD-GD18和pMD-GD4的最低检测限分别为4.64×10~3拷贝/μL、5.29×10~3拷贝/μL和1.16×10~3拷贝/μL,敏感性较高;采用该方法对39头份猪的肝脏、肺脏、脾脏和小肠内容物进行检测,阳性率为74.4%(29/39)。其中G1群PBoV的检出率最高,G2群检出率最低;G1群和G3群在4种样品中均有检出,G2群只在小肠内容物中有检出;同时本研究首次在肝脏中检出该病毒。本研究结果表明,PBoV感染情况复杂,存在多基因型的混合感染。本研究为进一步对病毒进行基因分型和致病性研究提供检测依据。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

猪博卡病毒1/2型NS1基因与3/4/5型VP1基因的双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测不同基因型猪博卡病毒(PBo V)的PCR方法,本研究参考Gen Bank中登录的5种基因型PBo V1、PBo V2、PBo V3、PBo V4及PBo V5,设计了2对引物,通过对扩增条件进行优化,建立了PBo V1/2和PBo V3/4/5的双重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时扩增PBo V样品327 bp(PBo V1/2)和209 bp(PBo V3/4/5)的特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒等其他病原核酸扩增均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V1/2和PBo V3/4/5的最低检出量分别为100拷贝/μL和1 000拷贝/μL。重复性试验显示该双重PCR检测方法具有良好的可重复性。应用该方法和单项PCR对30份临床样品进行检测,结果显示,同时感染PBo V1/2和PBo V3/4/5的阳性率为10%,并且两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适合对PBo V1/2和PBo V3/4/5的联合检测。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒4型双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

分别靶向猪流行性腹泻病毒(PEDV) M基因和猪圆环病毒4型(PCV4)ORF2基因，合成了2对特异性引物，建立了同时检测PEDV和PCV4的双重SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法。结果显示，PEDV和PCV4在一个反应体系中出现明显不同的熔解峰(Tm),PEDV的Tm值为84℃,PCV4的Tm值为79℃,而对其他常见的非靶标猪病毒没有显示特定的熔解峰，且对于PEDV和PCV4的最低检测极限分别为55.2,44.1拷贝/μL。利用本研究建立的双重荧光PCR方法对30份猪临床样品进行检测，结果显示，PEDV和PCV4的检出率分别为40%(12/30)和60%(18/30),PEDV和PCV4混合感染的检出率为33%(10/30),相较于常规PCR方法更加灵敏。该方法能够同时对PEDV和PCV4进行检测，极大地提高了检测效率和准确度，为PEDV和PCV4的诊断与防控提供技术支持。     

基于ORF3基因检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究参照已有的研究报告,对PEDV ORF3基因序列进一步比较优化,选择PEDV ORF3更为保守的序列设计引物,经PCR扩增目的片段后构建了PEDV ORF3基因的重组质粒标准品pMD18-T-ORF3,以其为模板,经反应条件优化,建立了基于PEDV ORF3基因的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.9982,Ct值与质粒标准品在102拷贝/μL～1010拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法除对PEDV检测结果为阳性外,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪圆环病毒3型和猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对重组质粒标准品的检测下限为102拷贝/μL,比普通RT-PCR灵敏100倍,敏感性高;批内和批间重复试验的变异系数均小于5%,重复性好。临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量RT-PCR检出阳性样品22份,而常规RT-PCR仅检出16份阳性样品,二者的符合率为82.86%。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。     

猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。     

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的PEDV M基因序列,设计并合成1对特异性检测引物,PCR产物为457 bp。结果显示:特异性试验,猪瘟病毒(CSFV)、大肠杆菌、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,具有好特异性;敏感性试验,最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV DNA;126份临床上疑似为PEDV感染的病料,RT-PCR检测结果与商品试剂盒符合率为100%。表明本试验建立的PEDV RT-PCR检测方法可用于临床上PEDV感染引起的传染病病原学检测。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

本实验建立猪博卡病毒(PBoV)PCR检测方法,并调查当前云南猪群中PBoV的感染情况。在GenBank数据库中对PBoV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增PBoV非结构蛋白NP1基因片段的引物,基于该引物建立PBoVPCR检测方法;用所建立的方法检测发生腹泻猪的粪便,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;以提取的PCV2、大肠杆菌的DNA为模板验证引物的特异性;并用核酸蛋白定量仪定量PBoV阳性样本的DNA,经梯度稀释后取1μL为模板确定所建立的PBoVPCR方法的敏感性;应用建立的PCR方法调查140份2015年云南省部分猪群样品中PBoV的存在情况。本实验建立的PCR方法特异性强,仅能扩增出PBoV,对PCV2、大肠杆菌核酸无交叉扩增现象;灵敏度高,对PBoV的最低可检出DNA浓度为0.1ng/μL;应用建立的PCR方法检测了140份采集自云南省部分地区的粪便样品,结果显示样本中PBoV的检出率为20%(28/140)。实验成功建立了检测PBoV的PCR方法,对云南地区猪群PBoV的临床诊断和流行病学调查等具有参考价值。     

猪博卡病毒3/4/5型PCR检测方法的建立及应用

通过分析GenBank上登录的猪博卡病毒3/4/5型(PBoV3/4/5型)基因序列,发现这些基因序列中存在一段高度同源性保守序列,针对该序列设计并合成1对引物,成功建立了可同时扩增出PBoV 3/4/5型的PCR检测方法。对2013年8月至2014年5月河南省50份临床腹泻仔猪小肠样品进行检测,结果 21份为PBoV阳性,阳性率为42%,表明PBoV在河南省猪群中存在一定流行。本试验建立的PCR方法对PBoV3/4/5的检测具有简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点,为PBoV 3/4/5型的快速检测提供了有效的技术支持。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

猪博卡病毒1/2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速和高通量检测猪博卡病毒(PBoV)的方法,本研究根据GenBank中登录的PBoV 1/2型NS1基因高度同源保守序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测PBoV1/2的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法对常见的其它病毒均未检测到荧光信号,而仅对PBoV1/2检测为阳性;其灵敏度为45拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;组内和组间变异系数均小于5%。本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,为PBoV的早期诊断和定量分析PBoV感染程度提供参考。     

鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株双重纳米RT-PCR检测方法的建立和应用

为了建立快速高效鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典株与变异株的检测方法,本研究参照GenBank中PEDV经典株CV777和变异株CH-HB1-2018的S基因序列,设计了3条特异性引物,并以纳米金颗粒作为热导介子,通过优化PCR反应条件,建立了能够区分PEDV经典株和变异株的双重纳米RT-PCR检测方法。利用该方法同时检测PEDV经典株和变异株、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),结果显示,该方法能特异性鉴别PEDV经典株(747 bp)和变异株(442 bp),且与其他病原均无交叉反应,特异性较强;将重组质粒标准品10倍倍比稀释后分别利用该方法和普通RT-PCR同时检测,结果显示,本研究建立的双重纳米RT-PCR方法能检测出经典株CV777和变异株CH-HB1-2018重组质粒标准品的下限分别为5.68×10~2拷贝/μL和4.93×10~2拷贝/μL,其敏感性较普通RTPCR的敏感性高100倍。利用本研究建立的方法对不同地区采集的阳性病料提取基因组后分别于同一时间和不同时间进行检测,结果显示该方法稳定性和重复性良好。利用该双重纳米RT-PCR方法对34份采集自河北省腹泻仔猪的样品进行检测,结果显示与普通RT-PCR检测结果符合率为97.1%,且PEDV变异株的阳性率高于PEDV经典株。本研究建立的双重纳米RT-PCR方法为PEDV病原鉴别检测及流行病学调查提供了可行的技术手段。