猪细小病毒基因组特性的研究

<正>猪细小病毒(PPV)属于细小病毒科细小病毒属的成员。猪细小病毒病是由PPV引起的以胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身无明显症状的一种母猪繁殖障碍性传染病。1967年,Carteright等对猪的不孕、流产、死产等进行病原学研究时首次报道了本病,并从猪的流产胎儿中分离到PPV。目前,此病在世界范围内广泛流行,是造成母猪繁殖障碍的主要病因之一。探究猪细小病毒的基因组特性对临床上防治该病毒的感染起到了至关重要的作用。最近30多年来,猪群中一直使     

猪伪狂犬病病毒（PRV-JL 株）的分离与鉴定

从吉林某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中分离出1株病毒，感染猪以后病理变化明显，经幼仓鼠肾传代细胞系（BHK-21）接种、毒价测定、病毒形态观察、PCR扩增及相关动物试验证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒，并命名为PRV-JL。经BHK-21接种，病毒生长良好；毒价稳定，可达10-7.59/0.2 mL；电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观，无囊膜的病毒粒子直径约110-150 nm，有囊膜的成熟病毒粒子直径约150-180 nm；PCR鉴定该毒株为强毒，其gE序列与Genbank登录的PRV gE序列同源性为99%-100%；本研究构建了小鼠的感染模型，并进行了病毒载量检测，结果用不同剂量病毒培养物接种Balb/C小鼠，小鼠死亡明显，最初在其脑组织中检测到PRV病原，随后在肾、肺、心逐步检出，试验初步证实了PRV的脑组织嗜性。试验表明， PRV-JL是1株强毒，对易感动物具有高致病性，为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定基础。     

枸杞多糖对小鼠体内外免疫巨噬细胞功能的影响

探讨枸杞多糖（LBP）对小鼠体内外免疫巨噬细胞功能的影响。本研究分别通过小鼠碳粒廓清实验、直接对小鼠原代单核巨噬细胞进行刺激和MTT比色的方法来研究枸杞多糖（LBP）对小鼠体内外单核免疫巨噬细胞的影响。     

猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3C的原核表达及生物信息学分析

为获得猪脑心肌炎病毒（EMCV）3C蛋白并进一步了解其结构,本研究以EMCV HB10株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增3C基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定,挑选测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其克隆至pET32a载体以构建重组原核表达质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌TranSetta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况,Western blotting检测纯化后3C蛋白及其对EMCV的反应原性。结果显示,成功克隆3C基因,长度为615 bp,编码205个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,3C蛋白主要以包涵体形式表达,His-3C蛋白大小约为40 ku。Western blotting分析可知,纯化后His-3C蛋白条带单一,同时3C蛋白与EMCV细胞毒有良好的反应原性。经生物分析软件预测可知,EMCV 3C蛋白为非分泌蛋白,无跨膜区,有多个磷酸化位点,参与蛋白的水解过程。3C蛋白酶作为EMCV基因组编码蛋白中唯一的蛋白酶,在病毒复制的过程中具有不可或缺的作用。本研究成功构建了EMCV 3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测,为进一步研究3C蛋白的作用及催化机理奠定基础。     

犬冠状病毒BC-1株核衣壳蛋白的原核表达及生物信息学分析

本试验对犬冠状病毒核衣壳蛋白编码的基因进行原核表达,并进行生物信息分析。结果显示,成功获得N基因,全长为1149 bp,编码382个氨基酸。SDS-PAGE显示,His-N重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为62 ku。W estern blot分析表明成功表达目的蛋白。生物信息分析发现CCo V BC-1株与CCo V A76株和CCo V HLJ-072株亲缘关系较近;CCo V N蛋白中含有3个结构域和9个潜在的优势抗原表位。     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法.方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10％成牛血清的DMEM培养液中培养.采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度.结果获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法.     

鉴别猪伪狂犬病病毒强弱毒的高效纳米PCR 检测试剂盒及初步应用

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因,用于区分PRV强毒与基因缺失毒株,优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒,对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验,并对临床样品进行检测。特异性试验表明,此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段,对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段,对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明,此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异,稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测,结果显示,PRV强毒阳性率为51%,阴性率为49%,未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义,而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。     

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂,以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性,即在一定比例的冷冻剂保护下,细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂,无论是DMSO,还是甘油,其比例只有在10%-15%之间,细胞复苏后的成活率才达到最佳状态,即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。