猪流行性腹泻病毒与圆环病毒2型复合PCR方法的建立

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)在腹泻仔猪中的感染状况,建立一种能同时检测PEDV与PCV2混合感染的复合PCR方法。根据Gen Bank已发表的PEDV、PCV2的基因序列,选择保守区域分别设计、合成1对特异性引物,扩增目的片段分别为530和278 bp。经反应条件优化,建立了特异性检测PEDV、PCV2的复合PCR方法。应用本试验所建复合PCR方法,对2016年4—8月采自四川省乐山、宜宾、广元和遂宁等地区的67份腹泻仔猪样品(肠系膜淋巴结、肠道黏膜及其内容物混合)进行检测。结果显示:PEDV、PCV2单一感染阳性率分别为34.33%、73.13%;PEDV+PCV2复合感染率为16.42%。经与特异性检测PCV2的PCR法和PEDV的RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验.特异...     

多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

猪圆环病毒2型LAMP可视化快速检测方法的研究

本研究旨在建立有效的针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及开发试剂盒。采用环介导等温扩增方法(LAMP)检测猪圆环病毒2型(PCV2),对PCV2的ORF2基因设计出3对特异性引物,扩增PCV2基因的最佳温度和时间优化到59℃孵育55 min。用该方法对临床样品进行检测,LAMP检测对PCV2的检测限为10拷贝/μL,而常规PCR检测法的检测限为1 000拷贝/μL,表明LAMP检测法灵敏度高。该检测法不会与猪圆环病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎的猪病毒和轮状病毒发生交叉反应。用建立起的LAMP检测法对1 100个临床样品进行检测,950个样品被检测出为阳性样品。稳定性试验表明该试剂盒可以耐受至少40次的反复冻融。结果显示,该方法建立的猪圆环病毒2型诊断方法灵敏度高,特异性强,稳定性好。     

新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

猪圆环病毒1型LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒1型(PCV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为现场诊断提供技术支持,本试验根据GenBank公布的PCV1全基因组序列,在其保守区设计了4条特异性LAMP引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测,首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明,62℃水浴60 min为最佳反应条件;LAMP的检出限为1×10~1 copies/μL,普通PCR最低检测限为1×10~3 copies/μL;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)进行扩增,结果显示为阴性;应用该方法对103个临床疑似病料进行检测,阳性率为34.0%(35例),普通PCR阳性率为29.1%(30例),两种检测方法符合率为89.5%。本试验为PCV1临床检测提供了一种特异、快速、成本低廉的方法。     

猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立能灵敏、高效、准确诊断猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,并运用该方法研究PCV3传播特性及组织嗜性,根据GenBank中PCV3 ORF2基因(MF631813.1)的核苷酸序列,设计合成PCV3的引物和探针,通过退火温度以及引物、探针用量和特异性等优化,建立了PCV3微滴式数字PCR检测方法.试验结果表明建立的猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法具有较好高的灵敏性、重复性和特异性,最低能检测到1μl 16.35拷贝的质粒标准品,可用于猪圆环病毒3型的早期诊断.     

检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

猪圆环病毒2型与3型双重PCR检测方法的建立

【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。     

猪圆环病毒3型PCR诊断方法的建立及初步应用

为屠宰环节PCV3分子流行病学调查诊断提供参考,根据猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)特异性序列设计引物,通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验及测序验证,建立的PCR方法能扩增出649bp的目标片段,其具有较好的敏感性,可扩增的最低模板浓度为0.143ng/μL;并用建立的PCR方法对屠宰场送检的376份组织样品进行检测结果表明,PCV3平均阳性率为12.9%。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据Genebank数据库中猪圆环病毒2型ORF2基因的保守序列设计了一对特异性引物,对PCR各项参数优化的基础上建立了检测猪圆环病毒2型的PCR方法,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪圆环病毒2型的早期确诊和病毒鉴定。应用该方法对浙江地区的142份病料进行应用检测,结果感染率为56.3%,表明浙江地区的PCV2感染已相当严重。     

猪非典型性瘟病毒与猪流行性腹泻病毒双重PCR方法的建立与应用

为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RV)的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65×10~5和1μl 3.56×10~4,对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测,PEDV、APPV阳性病料检出率分别为41. 18%和11. 76%,经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性,可用于临床检测。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种可以定量检测猪圆环病毒3型(PCV3)的荧光定量PCR检测方法。【方法】设计与验证1对PCV3特异性引物,以系列稀释后的PCV3全基因组质粒为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增。【结果】该方法不能检出PCV1与PCV2等常见猪DNA病毒,精确灵敏度至少达到100 copies,所绘制标准曲线回归方程的决定系数为0.999,扩增效率为83.6%,对53份临床样品的检测阳性率高于常规PCR。【结论】建立1种具有良好特异性、敏感性与重复性的定量检测PCV3的荧光定量PCR方法。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用

为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)与猪圆环病毒3型(PCV-3),并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体系后进行特异性和灵敏性的测定,并对西藏林芝周边地区藏猪粪便...     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量 PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型（PCV3）和 4 型（PCV4）的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，根据 GenBank 已登录的 PCV3 和 PCV4 基因保守序列设计特异性引物和 TaqMan 探针，经优化各反应条件，构建标准曲线，分析其敏感性、特异性和重复性，并利用建立的荧光定量 PCR 方法对采自安徽省的临床样品进行检测，与普通 PCR 方法进行一致性评价。结果显示，PCV3的标准曲线为Y=-3.534 6 logX+41.11（R²=1.00），PCV4的标准曲线为Y=-3.382 5 logX+40.67（R²=1.00）。PCV3 和PCV4 的检测限分别为49.5 和27.1 copies·μL ^-1。对猪圆环病毒1型（PCV1）和 2 型（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）无特异性扩增，组内和组间变异系数均＜1%。临床样品检测结果显示， PCV3阳性检出率为 40.8%，PCV4 阳性检出率为 20.4%，混合感染率为 19.0%。建立了灵敏、特异，可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。