二乙烯亚胺在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株灭活疫苗中的应用

[目的]通过甲醛和二乙烯亚胺对猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株的灭活效果比较,获得一种适合猪流行性腹泻病毒疫苗灭活的生产工艺.[方法]将二乙烯亚胺接种小白鼠观察二乙烯亚胺的毒性.分别使用甲醛和二乙烯亚胺,在室温条件下灭活PEDV-WN株病毒液8、12、16、20和24 h,取灭活后的病毒液接种生长良好的单层Vero细胞,进行灭活效果的检验;同时,取灭活检验合格的病毒液进行无菌检验.灭活合格的病毒液乳化配苗,进行安全性和效力试验.[结果]接种二乙烯亚胺的小白鼠28 d均健活,状态良好;甲醛体积分数为0.3％,灭活16 h可使病毒液完全灭活;二乙烯亚胺浓度为0.010 mol/L,灭活12 h可使病毒液完全灭活;灭活合格的病毒液无菌;将不同方法灭活后的病毒液乳化配苗,接种3～5日龄的仔猪,安全性较好,未观察到不良反应,然后用PEDV-WN毒株攻毒,二乙烯亚胺灭活制备的疫苗比甲醛灭活制备的疫苗保护率高.[结论]在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株病毒液中加入浓度为0.010 mol/L的二乙烯亚胺,在室温灭活12 h,可使病毒完全灭活,且制备的疫苗安全性好,保护率高.     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及N基因序列分析

[目的]了解引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒是否为变异株.[方法]从疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场采集死亡仔猪的肠黏膜及其内容物,将病料常规处理后接种VERO细胞,采用维持培养液加10 μg/mL的胰酶的方法分离培养.用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归实验以及部分序列分析等方法对分离株进行鉴定.[结果]病料在接入细胞第一代即出现病变,细胞肿胀变圆,形成合胞体,逐渐脱落,细胞病变明显.随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐稳定,进行RT-PCR检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验,最终确定分离株符合PEDV特征,并命名为BJ2015,测定毒株的TCID50为10-6.4/0.1 mL.基因测序结果显示,N基因长1 329 bp,编码442个氨基酸.与参考株N基因核苷酸序列比对及遗传进化分析表明,BJ2015与传统株CV777亲缘关系较远;与流行变异株BJ-2011-1N基因在进化树的同一个分支上,二者的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％、99.5％,表明BJ2015与BJ-2011-1亲缘关系较近.[结论]结果表明BJ2015为PEDV流行性变异毒株.