3株猪流行性腹泻病毒M基因克隆与序列分析

【目的】了解近年来京津冀地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株M基因的变异情况。【方法】用RT-PCR技术从京津冀地区部分仔猪腹泻样品中扩增与克隆3株PEDV流行株M基因全长序列,并进行序列测定和分析。【结果】基因序列结果显示,3株PEDV的M基因全长均为681nt,其核苷酸同源性达99.7%以上,在系统发育进化方面属于同一簇。M基因系统发育进化关系显示,虽然这3株PEDV与中国以前PEDV流行毒株及疫苗株CV777属于不同的簇,但其与国内外其他PEDV参考毒株的核苷酸同源性均达96.5%以上。【结论】M基因仍然是检测PEDV的良好目的基因。     

猪流行性腹泻病毒5株安徽流行株M基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明,5株PEDV安徽流行毒株M基因的全长均为681 bp,编码226个氨基酸,核苷酸同源性为99.1%～99.9%,其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%～100%。进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。     

闽西地区猪流行性腹泻病毒N基因分子进化及序列分析

分析闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的遗传进化特征,收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份,用逆转录PCR(RT-PCR)扩增N基因,连接至pMD-18T载体进行测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示,8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%,推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明,闽西毒株氨基酸序列存在15处突变,与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株,与疫苗毒株亲缘关系较远,可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株,不能给猪群提供很好的免疫保护,因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。     

猪流行性腹泻病毒流行株M基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法对收集的2株猪流行性腹泻病毒(PEDV)临床毒株(D1、D3)的M基因进行克隆,并对其核苷酸和推导的氨基酸序列进行分析。结果表明:2株PEDV流行毒株M基因间核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为97.8%。流行毒株D1与参考株EAS1、SM98、CHM2013分离株亲缘性较近,流行毒株D3与参考株PEDV-LY、PEDV-WS、CH22分离株亲缘性较近。与参考株CV777相比,D1株M蛋白有4个抗原决定簇的位置和序列组成发生了变化。     

陕西省猪流行性腹泻病毒S基因克隆与生物学信息分析

【目的】分析2014-2021年陕西省猪群猪流行性腹泻病毒（PEDV）主要毒力基因的生物学信息特征,揭示陕西省PEDV流行毒株基因变异情况,为防控猪流行性腹泻提供理论参考。【方法】参考PEDV全基因序列设计4对引物,采用RT-PCR方法分段扩增10株陕西省PEDV流行毒株S基因。利用生物信息分析软件,将获得的PEDV流行毒株S基因与GenBank中公开的57株PEDV序列进行比对分析。【结果】获得了10株陕西省PEDV流行毒株S基因全序列,长度为4 149～4 167 bp。将序列上传GenBank,获得相应的登录号为OL855978～OL855987。系统进化树分析显示,67个PEDV毒株分为G1a、G1b、G2a和G2b 4个亚群,10株PEDV流行毒株均属于G2b亚群,且遗传距离较近,与我国多个省区近年流行毒株亲缘关系较近。同源性分析结果表明,10株流行毒株之间S基因核苷酸序列同源性为95.4%～98.3%,氨基酸同源性为91.0%～98.1%;10株流行毒株与疫苗毒株S基因核苷酸序列同源性为91.7%～98.5%,氨基酸同源性为87.8%～98.5%。与G1a亚群的SD-M、CV777疫苗毒株核苷酸、氨基酸相比同源性均较低,而与G2b亚群的AJ1102、LNCT2、LW/L、XJ-DB2疫苗毒株核苷酸、氨基酸相比同源性均较高。与CV777 S蛋白相比较,共有88个氨基酸位点出现变异,变异位点占总位点数的6.36%（88/1 383）,其中在59～62位氨基酸有7株毒株出现了QGVN插入,在140位氨基酸有8株毒株出现N插入,在160～161位氨基酸有7株毒株出现DG缺失。S蛋白主要的中和表位、抗原表位和单抗识别表位出现多个变异位点。二级结构预测发现,与CV777相比较,多数流行毒株S蛋白的α螺旋、无规则卷曲占比稍有增加,β转角、延伸占比有所下降。S蛋白糖基化位点预测结果表明,与CV777株相比,流行毒株有多个引入或缺失的糖基化位点。【结论】陕西省PEDV流行毒株S蛋白抗原性发生了较大变化,推测疫苗免疫保护效果下降与此密切相关。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及N基因序列分析

[目的]了解引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒是否为变异株.[方法]从疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场采集死亡仔猪的肠黏膜及其内容物,将病料常规处理后接种VERO细胞,采用维持培养液加10 μg/mL的胰酶的方法分离培养.用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归实验以及部分序列分析等方法对分离株进行鉴定.[结果]病料在接入细胞第一代即出现病变,细胞肿胀变圆,形成合胞体,逐渐脱落,细胞病变明显.随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐稳定,进行RT-PCR检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验,最终确定分离株符合PEDV特征,并命名为BJ2015,测定毒株的TCID50为10-6.4/0.1 mL.基因测序结果显示,N基因长1 329 bp,编码442个氨基酸.与参考株N基因核苷酸序列比对及遗传进化分析表明,BJ2015与传统株CV777亲缘关系较远;与流行变异株BJ-2011-1N基因在进化树的同一个分支上,二者的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％、99.5％,表明BJ2015与BJ-2011-1亲缘关系较近.[结论]结果表明BJ2015为PEDV流行性变异毒株.     

江苏省猪流行性腹泻病毒的流行病学调查

[目的]分析江苏省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况.[方法]采用RT-PCR方法对2013年3月至2014年12月从江苏省9个不同地区采集的174份病料进行病原学检测和流行病学调查,并对来自不同地区9株病毒的部分M基因进行克隆、测序和分析.[结果]江苏省PEDV的个体阳性率为17.92％,猪场阳性率为61.54％;与经典病毒株CV777相比,9株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列都有突变.同源性分析表明,江苏省内PEDV毒株的核苷酸同源性为97.8％ ～ 100.0％,但与欧洲毒株的同源性较低;遗传进化分析表明,江苏省PEDV流行株和参考株可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,7株江苏省毒株和一些其他国内毒株、泰国毒株、韩国毒株以及美国毒株属于Ⅰ群,而另外2株江苏株与2株泰国株构成了Ⅲ群,而现用疫苗株CV777则属于Ⅱ群.[结论]江苏省内PEDV有一定程度的进化和变异,并且需要选择更有效的疫苗株来控制PEDV的流行.     

2014—2018年猪流行性腹泻病毒N基因遗传变化分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的分子流行病学情况,采用RT-PCR方法对2014—2018年采集到的河南、河北、山东、山西、甘肃、湖北、江西以及上海8省市共205份疑似PEDV阳性病料进行PEDV检测,使用RT-PCR方法扩增得到PEDV的N基因片段,回收PCR产物并与pMD20-T载体进行连接,挑选阳性克隆进行测序,分析研究PEDV遗传变异情况。结果显示,205份样品中,有191份样品为PEDV阳性,共得到19株PEDV的N基因序列,N基因全长均为1 326 bp,没有碱基的缺失和插入;将检测到的PEDV的N基因序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸的同源性为94.8%～99.5%,氨基酸的同源性为95.0%～99.3%。进化树分析发现,得到的19株N基因序列与CV777、CH-S等国内外毒株亲缘关系较远;其中,16株与MN、USA-Indiana-2013、USA-Iowa107-2013等近年分离株在一个分支上,为G2a亚群;CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CH-HENZMDPY-2017这3株序列形成另一个分支,为G2b亚群。综上可知,我国PEDV流行广泛,病毒变异频繁。研究结果可为新型疫苗研发以及检测方法的建立奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒E和M基因的克隆及变异分析

为了解2012-2014年福建省流行PEDV毒株E和M基因的变异情况,对19株PEDV的E基因和18株PEDV的M基因进行克隆和序列分析。结果表明:与CV777标准毒株相比较,福建流行PEDV毒株的E和M基因存在编码的部分氨基酸变异。19株PEDV E基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.4%~100.0%和97.0%~99.6%。18株PEDV M基因的核苷酸之间的同源性为97.4%~100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.2%~99.6%和97.5%~98.4%。核苷酸遗传进化树表明福建流行PEDV毒株的E基因与CV777亲缘关系较近,而M基因与2008年泰国流行的KU05CB08毒株亲缘关系较近,是个新的基因型,可能源于泰国。     

IBV陕西分离株M基因的克隆与遗传变异分析

为了研究IBV陕西分离株M基因的遗传变异情况及分子特征,参照NCBI所登录的IBVM基因序列设计了1对引物,应用RT-PCR方法对陕西8株IBV分离株的M基因进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析,并对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明,8个IBV分离株间的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸同源性分别为92.3%~99.8%和95.4%~100%,分离毒株与参考毒株的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸序列同源性分别为87.4%~99.5%和89.4%~99.5%;分离毒株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100氨基酸肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构;分离毒株的M蛋白均包含有3个跨膜区。表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。     

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。     

15株猪流行性腹泻病毒河南株ORF3全基因的克隆与序列分析

为调查近年来河南省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,从2015—2017年河南部分地区猪场患腹泻仔猪的小肠组织及内容物中克隆了15株PEDV ORF3基因,并对其进行了序列测定及分析。结果显示,15株PEDV河南株 ORF3 基因序列长度均为675 bp。15株PEDV分离株之间核苷酸同源性为94.4％～99.9％,与经典毒株CV777、弱毒株attenuated DR13核苷酸同源性分别为95.7％～97.0％和96.6％～98.1％。遗传进化分析显示,PEDV分为两大群,3株分离株属于G1群,单独成一个小的分支。其余12株分离株与往年河南流行株、大部分国内分离株、韩国、日本、美国及法国毒株位于G2群,亲缘关系较近,而与经典毒株CV777亲缘关系较远。表明河南省PEDV有变异和进化趋势,为河南省PED的防控和疫苗的研制提供技术支持。     

福建省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

为探讨福建省猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3基因遗传变异情况,于2014-2015年从福建省不同地区猪场扩增8株PEDV的ORF3基因,并进行序列比对及遗传进化分析。结果表明:8株分离株均为野毒株;与近年来国内及其周边国家的分离株亲缘关系较近,其核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性最高高达100%;与经典株CV777亲缘关系较远,其核苷酸及推导的氨基酸同源性达96.0%~96.9%与92.5%~94.7%;表明近年来福建省PEDV流行株较以往的经典株已经发生了改变。     

陕西省猪瘟流行毒株E0和E2全基因分子特征分析

【目的】分析目前陕西省猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的E0、E2全基因分子特征,为猪瘟防控提供参考。【方法】根据CSFV Shimen株及HCLV株全基因序列,设计并合成了4对引物,采用RT-PCR方法,从采自陕西不同地区的猪瘟病料中扩增E0、E2全基因并进行序列测定分析。【结果】从采集的病料中成功扩增了5株猪瘟流行毒株的E0、E2全基因,这5株流行毒株E0基因核苷酸同源性在94.4％～99.8％,与参考毒株ALD、Alfort187、Brescia、CAP、Glentorf、GPE、GXWZ02、HCLV、Paderborn、Rimes和Shimen的核苷酸同源性在80.4％～96.3％,氨基酸同源性在86.5％～99.3％。5株流行毒株E2基因核苷酸同源性在91.1％～98.0％,与参考毒株的核苷酸同源性在77.7％～94.6％,氨基酸同源性在85.2％～95.9％。5株流行毒株E0 Rnase活性区域氨基酸基序位点没有变异,但导致流行毒株发生免疫逃逸的E2蛋白关键位点中有3个发生了变异。【结论】测定的陕西省猪瘟流行毒株E0、E2基因序列变异明显,其中E2蛋白关键位点变异较大。     

广西仔猪腹泻病毒病原流行病学调查

【目的】了解引起广西仔猪腹泻的主要病毒病原及其分子流行病学特点,为其防控提供理论依据。【方法】采用RT-PCR对2011年至2012年7月从广西11个城市的养猪场采集的232份病料进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）检测和流行病学调查;对部分PEDV阳性病料的M基因进行克隆,并与国内部分省（市）及国外的一些M基因序列进行比对和遗传进化分析。【结果】广西11个城市采集的232份病料中PEDV、PoRV的阳性率分别为37.50%和0.03%,而TGEV均为阴性。对部分PEDV阳性病料进行M基因扩增,获得14条M基因,其核苷酸同源性及推导氨基酸序列同源性分别为97.4%~100.0%和96.0%~100.0%。将扩增获得的14条PEDV M基因与GenBank上发表的40条国内外PEDV M基因进行比对分析,发现有13条同位于一大支上（G1）,其中9条与我国2011年分离获得的广东、四川、江苏参考株及泰国2008年分离获得的5条参考株、韩国2007年分离获得的两条参考株同位于G1-1上,4条与我国2011年分离获得的江西、江苏、广东、福建毒株及江苏2004年分离株JS-2004-2 同位于G1-2上。另外一条PEDV M基因（NNA-11）却与其余13条相距较远,位于G2上。【结论】从2011年至今致使广西仔猪腹泻的病毒主要是PEDV,各市均有不同程度感染,且感染全年存在;大部分广西流行毒株与2011年以来我国广东、福建、江苏、江西四省流行毒株的亲缘性较高,与2007年以来泰国、韩国的流行毒株亲缘关系也非常密切,但与我国2006年前分离获得的北方毒株、经典疫苗株、韩国疫苗株相距较远。     

西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌毒力基因检测与进化分析

为调查西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的流行情况,利用PCR检测和生物进化分析方法,对西藏林芝、拉萨不同地、市149株牦牛源大肠杆菌的肠出血性大肠杆菌相关毒力基因进行了研究。结果表明:牦牛源肠出血性大肠杆菌6对毒力基因中,只检出ehxA基因,检出率为9.40%;对检测到的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。因此,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌基因确实存在,其毒力基因主要为ehxA基因;西藏林芝、阿里、日喀则、昌都均有分布,拉萨、山南和那曲地区未检出,应引起重视。西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测肠出血性大肠杆菌引起的腹泻,建立流行毒株预警机制并合理用药。     

鸡传染性法氏囊病毒BJ 10株分离鉴定及其VP2基因序列分析

分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV),并对其VP2基因进行序列分析。从陕西宝鸡地区疑似疫情的鸡群分离到1株IBDV（命名为BJ 10株）,应用血清学琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion test, AGID),结果在抗原孔和血清孔间可见明显的白色沉淀线。通过RT PCR扩增VP2基因高变区并对其进行生物信息学分析,结果表明,BJ 10株与超强毒株中国香港HK46的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.7%和 99.6%,且高变区特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,表明BJ 10株属于超强毒株,与香港地区的vvIBDV分离株有较为密切的亲缘关系。     

猪红斑丹毒丝菌GZ株的分离鉴定及序列分析

2013年11月从广州某猪场发生急性败血症死亡的母猪心脏、肺脏、脾脏分离到1株病原菌,经形态学观察、培养特性、生化特性及16SrRNA、spaA基因测序,确定为猪红斑丹毒丝菌,命名为GZ株。结果表明,该菌株对阿莫西林、利福平、庆大霉素、头孢类抗生素高度敏感,对其他药物广泛耐药,对BALB/c小鼠的致死剂量为1.5×108 cfu/mL。测序结果与NCBI收录的猪红斑丹毒丝菌进行Blast比对分析,16SrRNA基因与不同地区分离自人、蛋鸡、猪、白海雕、野猪、野兔、鼠等动物的同源性为95.9%~99.8%。spaA基因与NCBI收录的分离菌株核苷酸同源性为98.9%~99.9%,氨基酸同源性为99.5%,3处发生突变,其中,第36位缬氨酸突变为亮氨酸,第203位异亮氨酸突变为蛋氨酸,第257位亮氨酸突变为异亮氨酸;与1998年和2006年日本1a型Fujisawa株的核苷酸同源性最高,为99.8%,因此确定分离的GZ株为1a血清型。