羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离鉴定的3株ORFV毒株保护性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。【结果】从病料中分离鉴定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析结果显示,ORFV分离株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,B2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%~97.9%和86.7%~97.4%;3个毒力基因的变异相对较大,尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%~97.3%,85.2%~97.0%和71.5%~98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明,ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分离株均与台湾分离株的亲缘关系最近。【结论】试验分离的ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的,且其毒力基因发生了较大的变异。     

ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。     

羊口疮病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为确定安徽肥东某山羊场发生的疑似羊口疮(ORF)的病原,利用MDBK细胞从送检的病羊唇部痂皮中分离获得病毒,通过PCR鉴定确定病原为羊口疮病毒(ORFV),并将其命名为ORFV/AH-FD/2016/China株。然后对分离株的B2L基因和F1L基因进行克隆、测序,并与其他ORFV序列进行遗传进化分析。结果表明:ORFV/AH-FD/2016/China株的B2L基因长1 137bp,编码279个氨基酸,F1L基因长1 023bp,编码341个氨基酸。与GenBank中收录的其他ORFV流行株相比,B2L基因的核苷酸同源性为96.9%~99.5%,推导的氨基酸同源性为95.5%~98.9%;F1L基因的核苷酸同源性为95.3%~98.3%,推导的氨基酸同源性为94.9%~99.1%。利用软件构建系统进化树,根据B2L基因遗传进化分析结果表明,该分离株与甘肃分离株的亲缘关系最近;根据F1L基因遗传进化分析结果表明,该分离株与福建分离株亲缘关系最近。基于B2L基因和F1L基因的遗传进化分析,其分离得到的病毒株与国内不同地区分离毒株的遗传差异不大。该研究为ORFV的后续研究提供了临床试验材料和流行病学依据。     

羊口疮病毒榆林株B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统的表达

【目的】克隆分析羊口疮病毒(ORFV)榆林株(ORFV-Yulin)的F1L基因序列,通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因,测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因(r B2L)和F1L融合基因(c F1L),利用碱基linker连接,通过重叠PCR方法扩增获得ORFV r B2L-linker-c F1L重组基因(r B2Lc F1L),将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-rB2LcF1L。将pBac-rB2LcF1L包装出杆状病毒,侵染sf9细胞,通过SDS-PAGE、Western-blotting以及质谱鉴定等方法验证目的基因r B2Lc F1L的表达。【结果】克隆获得了1 029bp的F1L全长基因,该基因高度保守,与FJ-MH2015株的序列相似性最高,核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和99.4%。系统进化分析表明,ORFV-Yulin株与XP(KU199840.1)、FJ-MH2015(KM675409.1)以及Shanxi(HQ221964.1)株同处于一个分支。PCR扩增获得了855bp的c F1L基因、1 180bp的r B2L基因及1 983bp的r B2Lc F1L基因,成功构建了pBacrB2LcF1L载体,并包装出相应的杆状病毒。B2L和F1L串联基因通过昆虫杆状病毒表达系统获得成功表达,表达产物的分子质量为80ku,且有部分重组蛋白能分泌到细胞培养基中。【结论】ORFV-Yulin株的B2L和F1L串联基因在昆虫杆状病毒系统表达成功。     

羊口疮病毒ORFV/GD-QY/01 株的分离鉴定

利用MDBK细胞对广东清远某羊场的痂皮病例进行病毒分离,获得一株ORFV,命名为ORFV/GD-QY/01。参考NCBI羊口疮病毒(Orf virus)保守基因B2L序列,设计一对特异性引物进行PCR扩增后测序;运用序列分析软件对获得的羊口疮病毒株B2L基因核苷酸序列与其他羊口疮毒株进行多序列比对,构建系统发育进化树。结果表明:接种病料悬液的MDBK细胞出现细胞病变,扩增出ORFV B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106、DQ904351)相似性最高(均为99.2%),亲缘关系最近。     

羊口疮病毒贵州株B2L基因的克隆及其分子特征分析

根据已发表的ORFV B2L基因序列设计引物,进行B2L基因的特异性扩增,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序。结果表明,贵州株的B2L基因长为1 137 bp。核苷酸序列比较、分析,结果表明,贵州株与湖北株(GU320351)同源性最高,达99.1%,与2003年北美分离株(AY278208)和2003年美国动物园分离株(AY424971)同源性最低,为97.1%,所推导氨基酸的同源性为96.3%~99.5%。说明贵州株B2L基因与参考毒株之间差异不大。该研究为贵州省羊口疮病毒疫苗选择提供理论基础。     

羊口疮病毒内脏和口唇感染株B2L和F1L基因的比较分析

【目的】分析内脏和口唇感染羊传染性脓疱病病毒主要致病因子F1L和B2L基因和蛋白的差异，为进一步研究该病毒的致病机制提供参考。【方法】对内脏和口唇感染株F1L和B2L基因进行PCR扩增后克隆测序，运用生物信息学软件对其序列及编码蛋白的二级结构、磷酸化位点和跨膜结构域进行预测和分析。【结果】内脏株和口唇株的F1L基因长度均为1 564 bp，分别编码342和343个氨基酸；B2L基因长度均为1 370 bp，均编码378个氨基酸。内脏和口唇感染株B2L基因核苷酸序列同源性为97.80%，氨基酸序列同源性为98.15%；两者的F1L基因核苷酸序列同源性为95.49%，氨基酸序列同源性为87.20%。氨基酸组成显示：内脏和口唇感染株B2L蛋白缬氨酸含量最高；口唇株F1L蛋白亮氨酸含量最高，内脏株F1L蛋白精氨酸含量最高。【结论】羊口疮病毒内脏和口唇感染株的B2L基因保守性良好，而F1L基因差异明显，本结果可为进一步研究羊口疮病毒致病机制提供参考。     

藏鸡NDV的分离鉴定及F基因的遗传进化分析

【目的】探讨藏鸡NDV的毒力和F基因的遗传进化特征。【方法】从采集的藏鸡病料中分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）和1日龄雏鸡脑内接种致死指数（ICPI）来确定分离株的毒力。采用RTPCR方法克隆藏鸡NDV分离株F基因,测序后进行序列分析,并进行进化分析。【结果】共分离鉴定出F5、FX10、F20、F74、F75、F17、F72、FH2等8株NDV,其中F17、F72、FH2为强毒株,其余5株为弱毒株。8株病毒F基因ORF均为1 662 bp,编码553个氨基酸,强毒株ORF编码产物含有12个半胱氨酸残基,弱毒株有13个半胱氨酸残基,比强毒株在27位(强毒株C²⁷变为R²⁷)多了1个半胱氨酸残基;有6个潜在的糖基化位点。分离的8株NDV与GenBank中发表的20株NDV参考毒株比较结果表明,F蛋白氨基酸序列变异位点较多,主要集中在8-30,97-124,45,385-386,402-403,479-494,509-520位氨基酸处,强毒株AA替代较集中,而弱毒株保守区较多且AA替代较分散。分离NDV株之间F基因编码区核苷酸序列同源性为83.5%～99.9%,其中强毒株之间同源性为95.2%～99.4%,弱毒株之间同源性为99.4%～99.9%。分离NDV株之间F基因编码的氨基酸同源性为87.5%～99.5%,其中强毒株之间同源性为95.3%～98.2%,弱毒株之间同源性为98.6%～99.5%。进化分析显示,3株强毒株均为基因Ⅶ型,5株弱毒株均为基因Ⅱ型。【结论】分离了8株藏鸡NDV,其中3株为强毒株,属于基因Ⅶ型;5株为弱毒株,属于基因Ⅱ型。     

中国新疆小反刍兽疫病毒F基因序列分析

为分析中国新疆小反刍兽疫病毒(PPRV)毒株分子演变特点和疫情传播路线,从GenBank数据库下载所有国家全部的PPRVF基因全序列,应用DNAStar软件,结合疫情毒株时空分布进行序列分析。结果显示,中国新疆PPRV株F基因全序列,与2014年小反刍兽疫情中河南和北京毒株核苷酸的同源性最高,为99.8%~99.9%,与中国西藏3个毒株核苷酸的同源性为97.7%,与中国采用的疫苗株核苷酸同源性为92.9%,核苷酸同源性最低的是肯尼亚毒株,与国外毒株核苷酸同源性最高的是印度毒株。F基因系统进化关系分析显示,中国新疆PPRV株属于基因Ⅳ系。F蛋白氨基酸同源性结果显示,除与科特迪瓦1989年毒株ICV89氨基酸同源性最低外,与其他氨基酸同源性比对结果均与核苷酸的比对结果一致。中国新疆PPRV株存在一定程度的变异,可能是由周边国家传入。     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其 M、N和E基因的序列分析

对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。     

陕西省猪瘟流行毒株E0和E2全基因分子特征分析

【目的】分析目前陕西省猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的E0、E2全基因分子特征,为猪瘟防控提供参考。【方法】根据CSFV Shimen株及HCLV株全基因序列,设计并合成了4对引物,采用RT-PCR方法,从采自陕西不同地区的猪瘟病料中扩增E0、E2全基因并进行序列测定分析。【结果】从采集的病料中成功扩增了5株猪瘟流行毒株的E0、E2全基因,这5株流行毒株E0基因核苷酸同源性在94.4％～99.8％,与参考毒株ALD、Alfort187、Brescia、CAP、Glentorf、GPE、GXWZ02、HCLV、Paderborn、Rimes和Shimen的核苷酸同源性在80.4％～96.3％,氨基酸同源性在86.5％～99.3％。5株流行毒株E2基因核苷酸同源性在91.1％～98.0％,与参考毒株的核苷酸同源性在77.7％～94.6％,氨基酸同源性在85.2％～95.9％。5株流行毒株E0 Rnase活性区域氨基酸基序位点没有变异,但导致流行毒株发生免疫逃逸的E2蛋白关键位点中有3个发生了变异。【结论】测定的陕西省猪瘟流行毒株E0、E2基因序列变异明显,其中E2蛋白关键位点变异较大。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。     

鸡传染性法氏囊病毒BJ 10株分离鉴定及其VP2基因序列分析

分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV),并对其VP2基因进行序列分析。从陕西宝鸡地区疑似疫情的鸡群分离到1株IBDV（命名为BJ 10株）,应用血清学琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion test, AGID),结果在抗原孔和血清孔间可见明显的白色沉淀线。通过RT PCR扩增VP2基因高变区并对其进行生物信息学分析,结果表明,BJ 10株与超强毒株中国香港HK46的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.7%和 99.6%,且高变区特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,表明BJ 10株属于超强毒株,与香港地区的vvIBDV分离株有较为密切的亲缘关系。     

多杀性巴氏杆菌分离鉴定及序列分析

旨在了解新疆地区多杀性巴氏杆菌主要流行株的特性。通过病原的分离纯化、PCR扩增及测序,分析8株多杀性巴氏杆菌的血清型,16S rDNA基因、ompH基因和ompA基因的差异。结果表明,3株羊源、2株牛源和1株禽源分离株为荚膜A型,1株牦牛源分离株为荚膜B型,1株标准株为荚膜E型,均具有很强的致病性。分离株与GenBank公布的代表株的16S rDNA基因、ompH及ompA基因同源性分别为93%~100%、93%~100%、98%~100%。ompH基因的ORF氨基酸C端最后10个氨基酸变化较大,分离到5株ompA基因的ORF氨基酸序列N端多出6个氨基酸（M-K-R-I-I-Q）替代原先的起始位置。可见：新疆主要流行株为强致病性的荚膜A型,且有出现变异趋势。     

白狐源星状病毒RdRp基因的鉴定及遗传演化分析

目的 探究广州动物园一例死亡白狐Alopex lagopus肾脏中鉴定出的星状病毒的遗传变异情况。方法 对死亡白狐进行剖检,利用半巢式RT-PCR对内脏器官进行病原学检测,对扩增出的病毒株的RdRp基因序列进行相似性分析。结果 死亡白狐的肾脏苍白肿大,被膜难以剥离,肾脏中检测出的星状病毒RdRp基因呈阳性。RdRp基因与9株参考毒株的核苷酸相似性为67.5%～96.2%,其中与香港猫源星状病毒1637F的核苷酸相似性(96.2%)最高。结论 本研究为星状病毒在野生哺乳动物间的跨种传播及肠外器官中的感染提供了依据。     

来自安徽不同地区黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）cp 基因的分子进化分析

为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。     

2株H9N2流感病毒的分离及HA基因序列分析

为掌握近年来H9亚型禽流感的流行状况和遗传变异规律,从河南、陕西发病养殖场采集病料,用鸡胚接种法分离病毒,并用RT-PCR法对分离出的H9N2AIV的HA基因进行扩增、克隆、测序及对得到的序列进行同源性和遗传性分析。结果表明:获得了2株H9N2亚型流感病毒,这2株病毒HA基因变异程度不大,核苷酸序列和氨基酸同源性分别为97.1%和97.8%,均属于BJ/1/94分支(Y280小分支)。从分子水平分析,这2株病毒均属于低致病力的H9N2禽源流感病毒。     

西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌毒力基因检测与进化分析

为调查西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的流行情况,利用PCR检测和生物进化分析方法,对西藏林芝、拉萨不同地、市149株牦牛源大肠杆菌的肠出血性大肠杆菌相关毒力基因进行了研究。结果表明:牦牛源肠出血性大肠杆菌6对毒力基因中,只检出ehxA基因,检出率为9.40%;对检测到的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。因此,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌基因确实存在,其毒力基因主要为ehxA基因;西藏林芝、阿里、日喀则、昌都均有分布,拉萨、山南和那曲地区未检出,应引起重视。西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测肠出血性大肠杆菌引起的腹泻,建立流行毒株预警机制并合理用药。