猪代尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其S基因分子特征分析

猪代尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一个新发现的致病性猪肠道冠状病毒,目前在中国部分省份养殖场的腹泻病猪中已检测到,并已证实在中国流行。本研究旨在探明PDCoV在浙江省的流行现状和分子演化特征。结果显示,建立的PDCoV一步法TaqMan探针荧光定量检测方法特异,检测灵敏度可达3.94×10²拷贝·μL^-1,扩增效率为108%,R²值为0.997,标准曲线方程为Y=-3.156X+1.826。2013年4月—2016年12月收集的258份仔猪临床腹泻样本中没有检测到,但在2017年1—4月检测阳性率达到50%(12/24)。获得的7个临床分离株的S基因与参考株相比,其核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.98%~100%和99.99%~100%;与最初在香港分离到的毒株和美国流行株相比,存在3个碱基缺失和一定数量的突变。以S蛋白进行分子演化分析,发现7株临床分离株均在代尔塔冠状病毒属进化分支上,且与中国分离到的其他PDCoV毒株在进化关系上较近,与美国、泰国等地分离到的PDCoV在进化关系上较远,提示PDCoV的流行株分布有一定的地域性。研究结果提供了浙江省地区PDCoV临床分离株的基因特性,为防控PDCoV引起的仔猪腹泻、加快流行株疫苗的开发提供了数据。     

猪Delta冠状病毒的流行病学调查及M基因序列分析

为了解猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)在发生腹泻疫情猪群中的感染情况,根据PDCoV M基因的保守序列设计了一对检测引物,建立了猪Delta冠状病毒的的检测方法,其最低核酸检测限量为3.92×10~3 copies/μL,特异性和灵敏度均较好。利用该方法对2015—2017年上海周边猪场的518份猪腹泻粪便样品进行检测,检测出25份PDCoV阳性样品,阳性感染率达4.8%。在所检出的阳性样本中,PDCoV与猪嵴病毒(Porcine kobuvirus,PKV)和猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)的混合感染率较高,分别为40%和48%;PDCoV与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)混合感染率为8.0%,未检测到PDCoV与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TEGV)混合感染的样本。随机选取10份PDCoV阳性样本,对扩增的M基因片段同源性进行分析,结果发现,10份样品中核苷酸同源性达95.0%—99.6%,与GenBank登录的PDCoV毒株的同源性为96.1%—100%,说明目前流行的PDCoV毒株的遗传差异不大,该研究可为了解PDCoV流行情况提供参考依据。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

浅析猪传染性胃肠炎的发生及综合防治方法

<正>猪传染性胃肠炎是猪的一种急性肠道传染病,是由冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒引起。该病发病急、传染快,主要是以呕吐、水样腹泻和脱水为特征。该病多发生于冬春寒冷季节,传播快、发病率高,一旦发病,会造成大批仔猪死亡,因此,对待此病要早发现,早确诊,早治疗,本文针对规模养猪场猪传染性胃肠炎的发生进行分析,并提出综合防治措施。一、致病原猪场的致病原是冠状病毒属、猪传染性胃肠炎病毒,镜检可见与"猪流行性腹泻"致病原仅有细微的差别,前者致     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR鉴别诊断

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）为套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）。该病是一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，各种年龄的猪均易感染，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其是哺乳仔猪受害最严重，该病主要发生于冬季，夏季也可发生。猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）为套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，是猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis，TGE）的主要病原。该病是一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水为特征的传染病，对新生仔猪具有高度致死率。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上的猪死亡率较低，多成僵猪，使养猪饲料报酬降低。     

仔猪腹泻防治

一、仔猪腹泻的类型1.病毒性腹泻①传染性肠胃炎。本病是猪的一种急性高度接触性肠道疾病。病原体为冠状病毒科冠状病毒属。②流行性腹泻。猪流行性腹泻是一种急性、高度接触性的传染病,以水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率为特征。流行性腹泻是独立的猪急性肠道传染病。③轮状病毒感染。本病系由轮状病毒感染而引起的急性肠道疾病,主要发生在哺乳期仔猪上。     

猪Ⅲ型干扰素原核表达及其抗病毒效果研究

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。     

一例规模化猪场有效防控流行性腹泻案例分析

2013年12月,陕西延安市某猪场发生了一种以怀孕母猪、初生仔猪急性腹泻为临床特征的疾病。结合病史和临床症状,通过实验室RT-PCR检测,最终诊断为猪流行性腹泻。通过以返饲为主的综合防控措施,该病的流行得到了有效控制。     

春季猪流行性腹泻的防治

猪的流行性腹泻是由冠状病毒引起的一种高度接触性传染病．以水泻、呕吐和脱水为特征,主要发生在冬春寒冷季节。又称冬季性拉稀病。新生仔猪感染该病后会严重脱水和死亡。死亡率接近100％。     

浅谈猪传染性胃肠炎的综合防控

猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE),是一种以2周龄以下仔猪的呕吐、脱水、严重腹泻和高死亡率为主要临床症状的病毒性肠道传染病,首次发现是在1933年的美国伊利诺斯州,近年来在欧洲、美洲及亚洲均有发生。不同日龄的猪都易感,尤其是10日龄以内的仔猪,死亡率高达100%。该病在规模化养殖场中危害严重,因此本文通过对该病的流行病学特点、致病机制、临床症状、诊断方法、疫苗研究等方面的学习,进而提出针对、有效地防控措施,更好地促进养猪业的健康发展。     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

小菜蛾阿维菌素和虫酰肼抗性品系对几种新型药剂的交互抗性研究

以敏感品系为对照,利用室内筛选获得的虫酰肼和阿维菌素高抗品系Teb-R和Aba-R,测定了小菜蛾对几种新型杀虫剂的交互抗性。结果发现:小菜蛾对虫酰肼产生高水平抗性后(抗性倍数185.5倍),对阿维菌素表现出中等水平交互抗性(41.0倍),对茚虫威(11.4倍)和溴虫腈(5.3倍)仅表现出低水平交互抗性,对多杀菌素(1.7倍)和氯虫苯甲酰胺(1.4倍)则没有表现出明显的交互抗性。用阿维菌素筛选Teb-R品系39代后获得阿维菌素高抗品系Aba-R(593.8倍),该品系对茚虫威(12.3倍)表现出中等水平交互抗性,对多杀菌素(7.9倍)表现出低水平交互抗性,对溴虫腈(2.7倍)和氯虫苯甲酰胺(0.9倍)的交互抗性不明显;同时该品系对虫酰肼的抗性也由阿维菌素筛选前的185.5倍下降到筛选后的28.0倍,也没有交互抗性。基于上述研究结果认为,使用虫酰肼防治小菜蛾出现抗性后,可以使用多杀菌素和氯虫苯甲酰胺进行替代防治,但不宜用阿维菌素、茚虫威和溴虫腈进行替代防治;利用阿维菌素防治小菜蛾产生抗性后,可以用溴虫腈、氯虫苯甲酰胺和虫酰肼进行替代防治,但不宜用多杀菌素和茚虫威。     

Characterisation of Neonicotinoid and Pymetrozine Resistance in Strains of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from China

Four strains of the Q biotype and one of the B biotype of the whitefly Bemisia tabaci collected from China were characterised for resistance to four neonicotinoid insecticides and pymetrozine. Q biotype strains showed moderate to strong resistance to imidacloprid, thiamethoxam and acetamiprid, but little or no cross-resistance to dinotefuron. Resistance to neonicotinoids was consistently associated with resistance to pymetrozine, despite the latter having a distinct (though unresolved) mode of action. The single B biotype strain proved largely susceptible to all the insecticides investigated. Resistance in the Q biotype strains was associated with over-expression of a cytochrome P450 monooxygenase gene, CYP6CM1, whose substrate specificity presumably accounts for the observed cross-resistance profiles.     

贵州山区做好玉米区域试验的经验与方法

玉米区域试验是在不同生态条件下,对新育成品种的丰产性、稳产性、抗逆性、适应性及品质性状等进行全面鉴定和综合评价的中间环节,是新育成品种能否通过审定推广的重要过程,是农业科研与农业生产的重要纽带,是新品种是否能在本地区推广应用的科学依据,做好玉米区域试验事关重大.