欧拉羊胎儿皮肤细胞的培养、保存与鉴定

用胰蛋白酶对欧拉羊胎儿皮肤组织进行热消化分离并培养原代细胞，通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞，扩大培养至第3代时用液氮保存，复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。结果显示，欧拉羊胎儿皮肤细胞呈成纤维型，复苏活力93.5%以上，生长良好，细胞生长曲线呈“S”型，最大增殖量为3.31×10⁵ mL^-1，倍增时间为26.2 h；细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性，连续传代培养在10代内生长正常。表明欧拉羊胎儿皮肤细胞分离培养成功，使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

奶山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

试验分别采用组织块贴壁法和消化分离法对奶山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功建立了奶山羊胎儿成纤维细胞系,并对该细胞系进行了形态学观察、生长动力学分析、细胞活力测定、核型分析和微生物检测等多种生物学特性分析.结果表明:成纤维细胞原代培养采用贴块培养时所需时间较长,消化培养有较多死细胞;传代细胞生长情况良好,群体倍增时间(PDT)约为40.4h;生长总体趋势呈"S"型;冻存后活力为92.3%,生长状况与冻存前一致;细胞染色体中二倍体(2 n=60)占主体;细菌、真菌和支原体检测结果均为阴性,细胞系的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准.     

流式细胞仪分析法检测黑熊成纤维细胞周期同步化处理效果

分离培养黑熊皮肤成纤维细胞 ,传 3代 ,分别经血清饥饿 2～ 6 d和 10 g/ L Nocodazole处理 2 4 h后 ,用流式细胞仪分析 2个处理组和对照组细胞的周期相 ,以研究黑熊成纤维细胞同步化处理后的细胞周期时相的变化 ,探讨核移植供体细胞的细胞周期对核移植胚胎发育的影响。结果显示 ,血清饥饿组、Nocodazole处理组及对照组的 G0 +G1 期成纤维细胞的百分率分别为 (85 .0 5± 7.0 0 ) % ,(4 5 .9± 3.7) %和 (5 9.3± 6 .7) % ;G2 / M期细胞的百分率分别为 (10 .4± 6 .8) % ,(4 6 .3± 4 .2 ) %及 (2 3.0 5± 1.0 5 ) %。表明血清饥饿法能较好地使黑熊成纤维细胞同步于 G0 和 G1 期 ;Nocodazole处理可以使细胞较大程度同步于 G2 和 M期。     

延边奶山羊耳成纤维细胞体外培养的研究

为了给延边奶山羊转基因核移植及乳腺生物反应器研究提供足够且状态良好的细胞,采取延边奶山羊耳部组织块,利用组织块贴壁法进行原代培养和传代培养,对于纯化了的成纤维细胞观察其生长状态,并对4代以后的成纤维进行生长曲线、核型分析,并对细胞进行冷冻复苏试验,检测细胞活力.结果表明,4～13代体外培养成纤维细胞的细胞形态及核型基本正常,13代以后,细胞染色体变异比例增加,15代以后,细胞生长速度减慢;冷冻复苏后的细胞除生长速度减慢外,其它细胞生物学特征均正常,基本符合体细胞克隆、转基因等试验的基本要求,可以用于试验研究.     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。     

兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立

通过物种体细胞培养和长期保存,可在细胞水平上保存珍贵的种质资源.采用组织块培养法培养耳缘组织原代细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查.结果表明:保存了兰州大尾羊27个个体的耳缘细胞,保存的细胞平均复苏活力97.6％,生长良好,形态呈成纤维型,生长曲线呈“S”型,最大增殖浓度3.01×105个·mL-1,倍增时间为26.1h,细菌、真菌、病毒和支原体检查为阴性,染色体为2 n=54,二倍体占88％.最终,成功培养并保存了兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞,使这一珍贵的种质资源在细胞水平上得以长期保存.     

奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究

为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。     

欧拉羊胚肾细胞的分离培养和鉴定

[目的]分离培养并鉴定欧拉羊胚肾细胞,为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。[方法]用胰蛋白酶热消化法分离并培养欧拉羊胚肾原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。[结果]欧拉羊胚肾细胞呈成纤维型,复苏活力90%以上,生长良好,生长曲线呈"S",最大增殖浓度为4.61×105/ml,倍增时间26 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。[结论]欧拉羊胚肾细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

大熊猫皮肤成纤维细胞在不同培养液中的生物学特性研究

采用199/EBSS、DM EM、DM E/H am’sF 12(1∶1)和H am’sF 12 4种基础培养液组成的培养体系,测定大熊猫皮肤成纤维细胞的贴壁率、生长速度和染色体数目变异率,并对不同基础培养体系中不同代次的大熊猫皮肤成纤维细胞形态进行观察,以探讨大熊猫皮肤成纤维细胞在商业化培养液中的生物学特性。结果表明:在上述4种培养体系中,大熊猫皮肤成纤维细胞前8代的贴壁率分别为81.07%、83.72%、86.00%和83.06%;培养的成纤维细胞经核型分析,二倍体的比例分别为78.60%、79.57%、87.27%和77.67%;生长速度由快到慢依次是199/EBSS、DM E/H am’F 12、DM EM和H am’F 12。综合试验结果,DM E/H am’sF 12组成的培养体系比较适合大熊猫皮肤成纤维细胞的体外培养;细胞贴壁率变化趋势表明,在DM E/H am’sF 12组成的培养体系中,成纤维细胞培养6~8代后应进行细胞的冷冻保存。     

莎能奶山羊初乳营养成分的研究

对不同泌乳期的莎能奶山羊初乳的化学组成成分进行了分析。结果表明:莎能奶山羊初乳中总干物质、灰分、蛋白质、脂肪含量均随泌乳期延长呈下降趋势。分娩后第一次(3h)所挤初乳中各指标含量最高,其中总干物质含量为21.32%,灰分含量为1.57%,蛋白质含量为10.24%,脂肪含量为6.61%(12 h),之后下降趋势都趋于平缓。分娩后第一次(3h)所挤初乳中乳糖含量最低,为1.93%,之后随泌乳期延长乳糖含量呈上升趋势。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存(英文)

[Objective] The aim of this study was to establish the in vitro culture system of chicken fibroblasts.[Method] Tissue explant method and enzymatic digestion method were used to separate and culture chicken skin fibroblasts respectively.The rate of cell growth,cryopreservation and recovery were compared.[Result] The primary chicken fibroblasts prepared by enzymatic digestion grew faster and converged together to form monolayer on 5 d post preparation;the passage cells prepared by these 2 methods grew at similar speed and formed monolayer within 2-3 d;homogeneous fibroblasts could be obtained by trypsin digestion and repeated attachment for 3-4 passages;there were 75%-80% of cells survived after cryopreservation and recovery;the growth curves of embryonic fibroblasts and skin fibroblasts were all normal and the two kind of cells still retained the normal number of chromosomes even at the twelfth passage.[Conclusion] The feeder layer cells needed for establishing ES cell lines could be obtained by culturing chicken fibroblasts through both tissue explant method and enzymatic digestion method.This study provided a basis for the successful establishment of ES cell lines.     

山羊精液冷冻保存技术研究

[目的]探索山羊精液的冷冻方法。[方法]以甘油为冷冻保护剂,采用细管法冷冻保存山羊精液,探讨甘油浓度和添加时间、冻结方法和解冻温度对山羊精液冷冻效果的影响。[结果]在稀释液中添加6%和7%甘油的处理组中,冻后精子活率与复苏率均显著高于添加3%、5%甘油的处理组。配液时添加6%甘油的处理组中冻后精子活率与复苏率均显著低于在4℃平衡后添加的处理组。把平衡的山羊精液分别在离液氮面3 cm处熏蒸9 min和-80℃冰箱中冻结9 min,前者的精子复苏率显著低于后者。在解冻温度分别为40、45和50℃的处理组中精子冻后活率与复苏率显著高于解冻温度为55和60℃的处理组,说明解冻温度以40～50℃为宜。[结论]在山羊精液冷冻保存中,甘油的最佳添加时间为4℃平衡后冻结前。     

Study on Isolation, Passage, Cryopreservation and Histology of Mouse Fibroblasts

The embryonic ages were determined for the best preparation of mouse fibroblasts. Four methods were adapted to verify cryopreservation of mouse fibroblasts. The results showed that embryonic cryopreserving method was best one with 0.86 of thawing viability. The embryos from 13-14d pregnant mouse were superior to 11-12d and 15-16d in isolating, growing, laying and living. The first 6 generations were better than following ones in the same aspects above. Cell laying time became longer and vailable time became shorter after the sixth generation. With culture time increasing, fibroblast nuclear size became larger, fibrous filament appeared among fibroblasts, and macrocyst vesicle with floccule appeared in the cells. Cyst vesicle structure with pyknotic granule appeared in 24h cultured fibroblasts and macrocyst vesicle also appeared in passaging fibroblasts.     

黄帝陵古侧柏花粉生活力及其保存方法的研究

以黄帝陵千年古侧柏花粉为试验材料,用离体萌发法测定花粉的生活力,研究不同保存方法对花粉萌发率的影响,探讨花粉含水量、投入方式、化冻方式对超低温保存效果的影响。结果表明:古侧柏花粉在9%蔗糖+0.01%硼酸的培养基中离体培养4 d萌发率最高。90 d内,随着保存时间的延长,室温（20℃）保存的花粉迅速失活,低温（0℃、-20℃）保存的花粉萌发率呈逐渐下降趋势,超低温（-196℃）保存的花粉萌发率最高且保持效果最好,为古侧柏花粉长期保存的适宜方法。在超低温保存中,花粉以未经干燥、直接投入液氮、37℃恒温水浴化冻5 min保存效果最好;花粉含水量、投入方式、化冻方式之间交互效应显著。     

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCRRFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%（123/180）,囊胚发育率为25.20%（31/123）;在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60 d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。     

玻璃化法超低温保存龙眼胚性愈伤组织的初步探讨

采用玻璃化法对不同基因型的龙眼胚性愈伤组织超低温保存进行了初步探讨.将保存一定时间的胚性愈伤组织于常温下用60%玻璃化溶液(2PVS2)装载30 m in,再于0℃下用PVS2溶液平衡60 m in;换新鲜的PVS2溶液,迅速投入液氮中保存;48 h后化冻.结果表明,具有原胚分化的胚性愈伤组织保存后的存活率明显高于普通胚性愈伤组织;40℃温水浴、25℃左右室温和自来水冲洗等3种不同的化冻方式对龙眼胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后的存活率具有同样的效果.     

液氮超低温保存对小麦种子发芽力与活力的影响

[目的]研究液氮超低温保存对小麦种子发芽力与活力的影响,为小麦种质资源超低温贮藏提供理论依据。[方法]选用收获后自然干燥的郑麦9023、皖麦48、扬麦158和安农1032（糯小麦）4个小麦品种种子,分别密封于塑料冷冻管中,放入液氮罐中保存7 d,取出后常温解冻24 h,采用幼苗生长测定、冷浸试验、电导率测定和模拟田间出苗率测定等方法,测定种子的各项活力指标。[结果]起始发芽率为87.7%~97.3%的小麦种子,液氮保存7 d后,其幼苗生长测定发芽率为82.0%~94.0%,冷浸试验发芽率为79.3%~98.0%,模拟田间出苗率为43.7%~58.0%。[结论]初步认为小麦种子可以进行液氮超低温保存。     

南美白对虾精子超低温冷冻保存技术研究

【目的】建立一种南美白对虾精子超低温冷冻保存方法,为南美白对虾优良种质的长期保存奠定基础。【方法】利用胰蛋白酶消化法获得游离的南美白对虾精子,分别使用灭菌天然海水、无钙人工海水、3％等渗NaCl溶液和0．9％生理盐水作为基础液,并以不同浓度的二甲基亚砜（DMSO）、甘油、甲醇及其与海藻糖的混合溶液作为抗冻剂,在4种不同降温程序下超低温冷冻保存南美白对虾精子,然后在不同的温度下复苏冷冻精子,以伊红-苯胺黑染色法检测精子存活率。【结果】使用1．00g／L胰蛋白酶消化精荚5min能获得大量游离的南美白对虾精子,以灭菌天然海水为基础液,以10％DMSO和0．25mol／L海藻糖为抗冻剂,在P．1降温程序（4℃平衡30min,以．5℃／min的速率降至-20℃;-20℃平衡5min,以-10℃／min的速率降至-80℃;-80℃平衡5min,然后置于液氮中保存）下超低温冷冻保存南美白对虾精子,经37℃水浴复苏后精子存活率最高。【结论】建立的南美白对虾精子超低温冷冻保存方法具有可行性,为南美白对虾精子冷冻保存库的建立提供了技术支撑。     

留兰香茎尖超低温保存及遗传变异分析

为了长久保存留兰香种质资源,以留兰香(Menthae spicatae L.)茎尖为材料,对其玻璃化超低温保存条件进行研究,并运用扩增片段长度多态性(AFLP)和甲基敏感扩增多态性(MSAP)对玻璃化超低温保存再生材料(处理组)的遗传与表观遗传稳定性进行分析。结果表明:留兰香试管苗于4℃低温锻炼28d,于添加2mol/L甘油的MS培养基中预培养4d,0℃下于PVS2中脱水50min,液氮保存1h或者更长时间,成活率最高,可达60%左右,再生植株分化正常;超低温处理后再生材料(处理组)与正常继代材料(对照组)之间未发现有DNA片段的差异;与对照相比,处理组的材料均发生了甲基化状态与水平的变化,全基因组DNA胞嘧啶甲基化水平降低,另外,甲基化与去甲基化位点比率分别为8.93%和12.3%,说明超低温处理能够引起DNA甲基化的变化。由此推测,DNA甲基化可能是植物适应超低温保存的机制之一。