大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法的优化

【目的】优化大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法。【方法】以解冻后的精子活力为参数,调控试验条件,筛选最佳精液稀释液和最佳抗冻剂,优化抗冻剂体积分数和精液稀释比例。【结果】5种稀释液中,稀释液Ⅳ效果最好,冻精活力为35.5(±2.7)%;甘油(GLY)、甲醇(METH)、二甲基亚砜(DMSO)等3种抗冻剂中,5%(V/V)DMSO处理的冻精活力为40.7(±2.5)%,显著高于5%GLY和METH处理的冻精活力;优化DMSO的体积分数发现,10%终浓度的DMSO对精液保护效果较好,冻精活力为54.6(±1.5)%;优化稀释液Ⅳ与精液稀释比例发现,稀释液Ⅳ与精液以3∶1体积比稀释时能达到良好效果,冻精活力可达65.4(±2.3)%。【结论】精液稀释液Ⅳ与精液体积比为3∶1,终浓度10% DMSO为抗冻剂,对大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存的效果最佳。     

刺参精子冷冻保存方法研究

为获得适宜的刺参Apostichopus japonicus精子冷冻保存技术,综合借鉴现有水产动物精子冷冻保存方法,对刺参精子降温方式、冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度进行了筛选,在筛选出适宜的刺参精子降温方式基础上,分别以煮沸消毒海水和超纯水为溶剂,加入葡萄糖、NaCl、KC1、海藻糖、无水CaCl2和冷冻保存剂[二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)或1,2-丙二醇(1,2-G)]配制冷冻保存剂终体积分数为5％、10％和15％的冷冻保存液(Aj-1～Aj-27),以体积比为1:1、1:2和1:3的比例混合精子与冷冻保存液进行冷冻保存,冷冻48 h后分别在37 ℃和30℃水浴条件下进行精子复苏,以精子活率、快速运动时间和精子寿命为指标,综合筛选冷冻保存刺参精子的适宜冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度.结果表明:将刺参精子与以超纯水为溶剂配制的Aj-20精子冷冻保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KC1、5 g/L海藻糖、0.1 g/L无水CaC12和终体积分数为10％的DM-SO)以体积比为1:2的比例混合,以三步法降温方式冷冻保存,并在30 ℃水浴短时迅速复苏,该技术方法为本研究筛选到的最优刺参精子冷冻保存方法;与本研究中其他冷冻技术方法相比,应用该优选方法冷冻保存的刺参精子在复苏后精子活率最大(19.00±4.00)％、快速运动时间最长(1 178.67 s±14.57 s)、寿命最久(2 817.33 s±93.76 s);应用该优选方法冷冻保存72、120、408 h的精子复苏后受精率可达70％以上(精子与卵子数量比为1×106:1),受精的卵囊孵化率可达到50％.研究表明,本研究中筛选获得的冷冻保存液配方及其冷冻保存方法比较适宜刺参精子的长期冷冻保存,具有应用于生产实践的潜力.     

SpermCryo无卵黄冷冻液对食蟹猴精子冷冻保存的影响

为了建立运用商品化人类精子无卵黄冷冻液SpermCryoTM All-round冷冻保存食蟹猴精子的方法,比较了快速(-435℃/min)、中速(-183℃/min)和慢速(-69℃/min)的降温速率以及不同冷冻平衡时间(10和30 min)对食蟹猴精子冷冻保存的效果.结果表明,在液氮上方冷冻平衡10 min对食蟹猴精子的复苏活力显著高于30 min.用快速和中速冷冻速率保存的精子的复苏活力较高,冻存精子的复苏活力明显高于慢速冷冻速率保存的精子.该研究建立和优化的SpermCryo无卵黄冷冻液冷冻保存食蟹猴精子的方法,可简单快速完成精子的冷冻保存,并获得较高的冷冻复苏存活率.该研究结果对深入研究灵长类动物精子冷冻损伤的机制和在辅助生殖中的应用具有重要意义.     

不同抗冻剂及初冻和解冻温度对鸡精液冷冻保存的影响

【目的】研究对不同抗冻剂及初冻和解冻温度在鸡精液冷冻保存中的效果.【方法】以‘海兰褐’种公鸡为试验材料,利用液氮制作颗粒冷冻精液,研究不同抗冻剂及初冻和解冻温度对鸡精液冻后活率、复苏率及存活时间的影响,并筛选出最佳的抗冻剂种类、浓度和初冻、解冻温度组合.【结果】3种抗冻剂组合的冷冻效果优于单一及两种抗冻剂组合,且GL 8%+DMA 6%+EG 6%组合的冻后活率、精子复苏率最高,分别为0.46和57.50%,为最佳抗冻剂组合;在此基础上,筛选出最佳初冻和解冻温度组合为-140℃和50℃,其冻后活率和复苏率最高,分别达到0.57和71.40%,并在15～25℃条件下精子存活时间为160min;在鸡精液冷冻保存中快速冷冻要对应快速解冻,慢速冷冻要对应慢速解冻,且前者精液冷冻保存效果较好.【结论】筛选出了最佳的抗冻剂组合及初冻和解冻温度,发现快速冷冻和解冻的鸡精液保存效果较好.     

马氏珠母贝精子低温保存主要影响因素的研究

采用二甲基亚砜(DMSO)和甘油作为抗冻剂,以海水或体液等为基础液,配制体积分数为6％、8％、10％和12％的抗冻保护液．将马氏珠母贝精液和抗冻保护液以1：2、1：5、1：10和1：20(体积比)混合后,置4℃中平衡30和60min,再于-18℃中冷冻4、24和72h,解冻后观察精子的活动状态和受精率．结果表明,抗冻剂种类、体积分数以及精液与保护液的比例对精子的活动状态有很大的影响;4℃的平衡时间对精子的存活率影响不显著,但对受精率却有明显的影响．在-18℃时,精液和抗冻保护液体积比1：20,DMSO体积分数为10％和12％的两组保存效果较好．精子存活率随着保存时间的增长而降低,但基础液的类型对精子受精率没有明显影响．     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

美洲鲥鱼精子超低温冷冻保存技术初探

对美洲鲥鱼精液的超低温冷冻保存技术进行了研究。以解冻后精子的活力为参数,探讨了鱼用任氏液为稀释液、不同体积分数甲醇为保护剂、不同冻前平衡时间以及不同精液稀释比对美洲鲥鱼精液进行超低温冷冻保存的保护效果。结果显示,以鱼用任氏液和体积分数为10%的甲醇组成抗冻保护剂,精液稀释比(精液与抗冻保护剂的体积比)为1∶3,于4℃冰箱平衡20 min,液氮面上方6 cm处平衡10 min,然后在液氮面上平衡5 min,最后投入液氮中的保存方式,保存60 d后检查精子活力,存活率可达80%。研究结果为保护淡水鱼类的种质资源提供了理论基础。     

兴国红鲤精液超低温冷冻保存及效果分析

对兴国红鲤精液的超低温冷冻保存技术进行了研究。以解冻后精子的寿命和运动力为参数,分别探讨了不同组合的稀释液、抗冻剂以及冷冻程序对兴国红鲤精液进行超低温冷冻保存的保护效果。试验结果表明,选用Ringer液为稀释液,8%DMSO为抗冻剂,按照程序-80℃平衡15 min,后保存于-196℃液氮中,37℃水浴100 s解冻,精液解冻激活后镜检,精子活力达到(83±9.6)%,寿命在(86.25±24.7)s,接近鲜精的水平。本研究结果为保护淡水鱼类的种质资源提供了理论基础。     

细胞凋亡相关Caspases在猪精子冷冻过程中的表达谱研究

【目的】探究不同冷冻保护剂冷冻猪精子后,精子中Caspases表达模式。【方法】采用普通PCR和荧光定量PCR技术检测Caspase-1~15在添加不同冷冻保护剂冷冻猪精子后的表达谱。【结果】①甘油和乙二醇可以抑制Caspase-2、-8、-13的表达,而DMSO只能抑制Caspase-2和Caspase-8的表达。②海藻糖和乳糖能有效地抑制Caspase-2、-8、-13、-15的表达,而蔗糖能有效地抑制Caspase-1、-6、-13和Caspase-15的表达。③超氧化物歧化酶和过氧化氢酶可以有效防止Caspase-2、-8和Caspase-13的表达,而谷胱甘肽仅可以有效地抑制Caspase-13的表达。④不添加抗冻剂冷冻对凋亡执行子Caspase-3和Caspase-7的表达没有影响。【结论】冷冻保存主要影响凋亡启动子在猪精子中的表达,添加甘油、蔗糖、乳糖能有效抑制猪精子冷冻解冻造成的凋亡。     

七日龄小鼠生精小管及睾丸的冷冻保存*

 在DMEM培养液中添加10%小牛血清（NBS）及10%二甲基亚砜（DMSO）作为冻存液，慢速降温冷冻，液氮保存7日龄小鼠生精小管及完整睾丸，37 ℃水浴复苏，0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，台盼蓝染色测定细胞复苏率。结果：生精小管及完整睾丸冷冻复苏后细胞复苏率分别为87.3%及85.0%，两复苏率之间无显著差异，与生精小管单细胞对照组相比也无显著差异。冷冻损失率分别为10.1%及12.4%。结果表明，对于7日龄小鼠生精小管及完整睾丸，以10% DMSO为抗冻剂，慢速降温冷冻，液氮保存，37 ℃水浴复苏是一种适宜的冷冻保存方法。     

凡纳滨对虾人工授精技术初步研究

【目的】筛选出有效的凡纳滨对虾人工授精方法,为后续的雌核发育诱导研究奠定基础。【方法】以受精率和幼体孵化率为考核指标,探讨外体精卵结合授精法、精荚移植法、精液移植法等不同人工授精技术对凡纳滨对虾繁育效果的影响。【结果】体外精卵结合授精法在各处理组均无幼体成功孵出,但在精子密度为2×107个/L和卵子密度为300枚/L,且在卵排出1 min内完成授精操作时,可获得相对较高的受精率(6.67%)。在精液移植法中,发现精荚在8℃恒温条件下保存3h内进行授精操作,仍可获得一定的受精率和幼体孵化率,超过3h后则无法实现受精;精荚保存温度以8~16℃为宜,保存温度升至25℃时则无法实现受精。3种人工授精技术中,以精液移植法的受精率和幼体孵化率最高,分别为52.33%和12.35%,其次是精荚移植法,体外精卵结合授精法的效果最差,无幼体孵出。【结论】精液移植法是凡纳滨对虾最有效的人工授精方法,但精荚保存时间不宜超过3 h,且应在雌虾排卵后1~2 min完成挤精荚和网搓释放精子溶液,同时可添加预先收集浓缩制备好的卵水溶液,以提高凡纳滨对虾的人工授精效率。     

不同低温持续胁迫对凡纳滨对虾存活的影响

【目的】了解凡纳滨对虾对低温持续胁迫的耐受力,为评估低温对凡纳滨对虾养殖业可能造成的风险及有效应对寒灾提供科学依据。【方法】设7、8、9、10和11℃5个低温持续胁迫试验组和一个空白对照组（室内自然水温20℃）,通过观察凡纳滨对虾对不同低温胁迫的行为反应并分别记录死亡历时,应用统计学方法拟合死亡率与死亡历时的关系模型。【结果】试验期间对照组凡纳滨对虾未出现死亡,存活率为100％。凡纳滨对虾在低温持续胁迫下,首尾死亡及100％死亡历时均随胁迫温度的升高而延长,7和11℃低温胁迫时,首尾死亡及100％死亡历时分别为2．6和13_3h、27．0和158．4h。凡纳滨对虾对低温反应敏感,7-11℃的持续胁迫均能导致其死亡,但死亡历时时域不一,7和11℃持续胁迫下,其死亡历时时域分别为24．4和145．1h,即死亡历时随胁迫温度的降低而缩短。5个低温持续期内凡纳滨对虾的死亡率与死亡历时回归方程R：的置信度均高于0．9500,在7、9、1ICE持续胁迫下,凡纳滨对虾死亡率与死亡历时的关系均符合幂函数方程,其幂函数指数分别为1．2751、1．0508和1．1173;而8和10℃持续胁迫下,死亡率与死亡历时的关系曲线更符合多项式。【结论】凡纳滨对虾不耐低温,低温胁迫致死过程有一定持续期,但死亡速度随胁迫温度的降低而加快,因此养殖过程遇低温季节应加强应急管理,最大限度规避寒害风险：胁迫温度较低（7℃）时,须在短时间内完成应急管理,最长应急处理时间为1d;胁迫温度较高（11℃）时,可适当延长应急管理,但最长应急处理时间不宜超过6d。     

奶牛一步细管法冷冻胚胎移植试验

以PBS+20%FCS+1.5 mol/L乙二醇(EG)+0.1 mol/L蔗糖(SU)液作为冷冻液,对122枚奶牛胚胎进行一步细管法冷冻,管内解冻,然后移植给122头受体黄牛,结果有49头供体牛妊娠,受胎率为40.09%,产犊率38.52%.结果表明一步细管法是一种可行性良好的便于在农牧区奶牛胚胎移植中推广的方法.     

凡纳滨对虾胚胎发育进程及诱导染色体加倍时间确定

[目的]了解凡纳滨对虾胚胎发育的时序及特征,为其雌核发育诱导中染色体加倍最佳操作窗口的确定及人工苗种生产提供参考依据.[方法]以人工培育成熟凡纳滨对虾“桂海1号”的受精卵为研究对象,观察并描述不同水温下卵子从产出受精至幼体孵化出膜的整个胚胎发育过程.[结果]根据凡纳滨对虾胚胎发育的形态特征变化,可分为7个阶段：受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠期、肢芽期、膜内无节幼体期和出膜幼体期.凡纳滨对虾受精卵在水温30.5℃、盐度28.6‰的条件下,整个胚胎发育过程需11.5～11.8 h.水温变化对凡纳滨对虾受精卵极体的排出和孵化时间有明显影响,水温每下降1℃,孵化时间需增加0.6h;在28.0～30.5℃的水温范围内,受精卵第一极体释放时间为7～13 min,第二极体释放时间为8～14 min,整个胚胎发育过程需11.5～13.0 h.其中,在30.5℃的水温条件下,第一极体释放的时间为7～9 min,第二极体释放的时间为8～10 min,即在水温30.5℃、盐度28.6‰的条件下,凡纳滨对虾受精卵染色体加倍诱导的最佳时间在卵子受精后8～10 min.[结论]在确保凡纳滨对虾受精卵正常发育的前提下,适当调低培育水温能延迟胚胎发育速度,为人工诱导受精卵染色体加倍创造较充足的操作窗口期.此外,受精卵是否均等分裂是判断凡纳滨对虾卵子受精与否的重要标准.     

家蚕人工授精关键技术的研究

［目的］ 研究高效的家蚕人工授精技术。［方法］ 取雌蛾交配约30 min后的交尾囊,通过挤压离心提取精细胞,胰蛋白酶处理后进行交尾囊注射。［结果］ 建立了家蚕精子细胞高效采集技术;2人解剖操作,每h可取得精液100 μl左右;显微镜观测精子细胞活率达80％以上;精液的纯度较好,家蚕的受精率平均达76.5％。［结论］ 高效家蚕精液提取处理技术的建立为家蚕精子其他相关技术的研究提供技术基础。     

凡纳滨对虾混养点带石斑鱼的研究

[目的]提高凡纳滨对虾的产量.[方法]利用生物防病原理,在凡纳滨对虾养殖中混养点带石斑鱼,研究其对凡纳滨对虾存活率和产量的影响.[结果]当凡纳滨对虾中混养点带石斑鱼密度为3000 尾/hm2左右时,凡纳滨对虾存活率和产量均达到最高,比单一养殖凡纳滨对虾存活率提高11.49％,平均产量提高3149.O kg/hm2.[结论]在凡纳滨对虾养殖中混养点带石斑鱼,能起到减少病害发生和降低养殖风险的作用.     

3种药物对凡纳滨对虾仔虾的毒性研究

［目的］探讨3种药物对凡纳滨对虾仔虾的急性毒性及相互关系。［方法］以480尾健康的凡纳滨对虾仔虾为试验对象,用高锰酸钾、甲醛、聚维酮碘3种药物分别进行单一药物和任2种药物组合对凡纳滨对虾仔虾的急性毒性和联合毒性试验。［结果］3种药物对凡纳滨对虾仔虾24、48、72、96 h的半致死浓度分别为,甲醛：70.21、43.56、37.65、26.22 mg/L;高锰酸钾5.54、3.74、3.22、2.84 mg/L;聚维酮碘 7.05、5.26、4.39、3.53 mg/L;其对凡纳滨对虾仔虾的安全浓度分别为2.62、0.28、0.35 mg/L。这3种药物毒性大小依次为：高锰酸钾＞聚维酮碘＞甲醛。［结论］聚维酮碘与高锰酸钾和甲醛对凡纳滨对虾仔虾的毒性表现为协同作用;低毒性强度的甲醛对高锰酸钾具拮抗作用,当高锰酸钾与甲醛毒性强度相当时表现为相互独立作用。     

卷叶贝母愈伤组织超低温保存关键技术研究

[目的]建立一套完整、快速和经济的卷叶贝母超低温保存关键技术。[方法]对卷叶贝母愈伤组织超低温保存技术中的预培养时间、保护剂类型和解冻方式进行了研究。[结果]预培养时间、冷冻保护剂类型和解冻方式均是影响卷叶贝母愈伤组织冷冻保存过程中的关键因素。经预培养9 d、由10%二甲基亚砜和0.5 mol/L山梨醇组合的复合冷冻保护剂冷冻、在40℃水浴条件下解冻的卷叶贝母愈伤组织其保存效果最佳,保存后细胞的存活率可达87.39%。[结论]为更好地保护卷叶贝母种质资源提供了参考。     

Cu^2＋·Zn^2＋·SDS·DBS对凡纳滨对虾仔虾的毒性试验

[目的]研究Cu^2＋、Zn^2＋和SDS、DBS对凡纳滨对虾仔虾的毒性,为对虾人工育苗用水的水质管理提供参考依据。[方法]用Cu^2＋、Zn^2＋ 2种重金属离子和十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基苯磺酸钠（DBS）2种阴离子表面活性剂对720尾凡纳滨对虾仔虾进行96h急性毒性试验。[结果]结果表明,Cu^2＋、Zn^2＋、SDS、DBS对凡纳滨对虾仔虾的毒性大小依次为Cu^2＋〉Zn^2＋〉SDS〉DBS;对凡纳滨对虾仔虾的安全浓度分别为0．014、0．028、0．320、0．800ms／L。[结论]Cu^2＋、Zn^2＋、SDS、DBS对凡纳滨对虾的毒性均随着处理浓度升高、处理时间延长而增强。