水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

孕早期家兔子宫内膜细胞的分离培养与形态观察

为探讨子宫内膜细胞的分离与体外培养条件、生长特点及其增殖过程,采用不同消化方法进行了孕早期家兔子宫内膜细胞的消化和分离培养试验。结果表明,多数情况下采用胰蛋白酶消化获得的细胞数量少且活率低于60%,而采用1g/L胶原酶 型消化获得的细胞数量多达1×106/cm3,且活率大于90%。经74μm(200目)滤网过滤分离培养出多角形和梭形2种形态的基质细胞及铺路石状的腺上皮细胞,并均能在体外培养和传代。     

山羊子宫内膜基质细胞的分离培养及鉴定

对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。     

牦牛子宫内膜腺上皮细胞分离培养方法比较

[目的]建立牦牛子宫内膜腺上皮细胞体外分离培养方法。[方法]分别采用组织块培养法和消化培养法分离、纯化牦牛子宫内膜腺上皮细胞。[结果]组织块培养约8d细胞可汇合成片,经胰蛋白酶分次消化,可得到纯化的子宫内膜上皮细胞;使用2g／L的胶原酶Ⅱ消化2．5h,更换新鲜消化液继续消化2．5h,消化悬液经74斗“滤网过滤,400r／rain离心5min,收集沉淀,重悬后自然沉降,可得到纯净的腺细胞团。免疫细胞化学显示所得细胞角蛋白染色阳性,阳性率达到95％以上。[结论]2种方法均可得到纯净的牦牛子宫内膜上皮细胞。     

小鼠子宫内膜上皮细胞体外培养方法比较

为探讨适用于小鼠子宫内膜上皮细胞的培养方法,对胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化+刮取法、Ⅰ型胶原酶消化法、Ⅰ型胶原酶消化法+刮取法、子宫翻转组织块培养法5种方法进行了比较研究.结果表明,胰蛋白酶消化法获得的上皮细胞数量稀少,活力低,生长速度缓慢;刮取法+胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、刮取法+Ⅰ型胶原酶消化法获得的细胞数量较单纯胰蛋白酶消化法多,但达不到研究所需的要求;子宫翻转组织块培养法获得的上皮细胞活力强,生长速度快,纯度高,比较适宜小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养.     

山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离培养和鉴定

为了探讨山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离、生长条件以及纯度鉴定,通过2 g/L的Ⅰ型胶原酶置于水浴消化4 h,200目的滤网过滤后进行低速离心,收集沉淀物,沉降洗涤3~5次,将细胞移至24孔培养板置37℃细胞培养箱中进行培养。12 h后开始贴壁生长,腺团开始向外部扩散,生长2~3 d,细胞扩散并出现明显的铺路石状,4~5 d腺团基本扩散开来并呈一定走向继续生长。经免疫组织化学方法进行细胞染色,细胞表达角蛋白的阳性率达90%以上。     

孕鼠子宫内膜上皮细胞分离、培养及活力检测

为探讨昆白系孕鼠子宫内膜上皮细胞的分离与体外培养条件、生长特点及其增殖规律,采用2．5 mg／mL胰蛋白酶+0．4 mg／mL EDTA分别以20,30,40 min消化子宫内膜,结合刮取法,对昆白系孕鼠子宫内膜上皮细胞的分离培养进行了研究。结果表明,随着消化时间的增加,所获得的细胞数目也增多,但细胞活力下降(噻唑兰法检测);消化30min所获得的细胞活力高、数目多,细胞比较单一;子宫内膜上皮细胞的活力随着细胞培养代数的增加而下降。     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究

建立可用于基因打靶的乳腺上皮细胞系是乳腺生物反应器研制的重要环节,分别采用胰蛋白酶、胶原酶及其两者的混合消化液分离获得了包括少量成纤维细胞在内的原代牛乳腺上皮细胞,比较了不同消化方法的优缺点。利用Trypsin-EDTA阶段消化法在体外培养牛乳腺上皮细胞,观察了此细胞培养到第5代、10代、15代和20代时的细胞形态特征和生长特性,比较了该细胞在胶原基质和混合型基质包被培养皿中的培养效果。以乳腺腺泡上皮细胞中的细胞特征蛋白角蛋白18为标志,利用角蛋白18单克隆抗体进行了细胞免疫组化鉴定,证明分离培养细胞的上皮特性。     

茶多酚对人胚肺细胞和猴肾细胞毒性的实验研究

通过体外实验,研究了绿茶中提取、纯化的茶多酚对人胚肺细胞和猴肾细胞的毒性作用,结果表明：当细胞培养液中茶多酚浓度分别为５００μｇ和６００μｇ作用１２小时后,大约有５０％的人胚肺细胞和猴肾细胞的生长受到抑制,随着细胞培养液中茶多酚浓度的提高和茶多酚对细胞作用时间的延长,茶多酚对这两种细胞的毒性增强。     

ST细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)引进ST细胞系,扩大培养后液氮冻存建立了种子细胞库和工作细胞库;细胞复苏后对细胞的活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行了研究。结果表明,ST细胞系呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、病毒、支原体检测均为阴性;染色体为19对;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库,可为开展ST细胞及猪瘟疫苗的研究提供基础理论依据和细胞资源。     

薯蓣皂苷元对HL-60细胞增殖及细胞周期的影响

采用XTT比色法和流式细胞仪技术观察薯蓣皂苷元(Diosgenin，Dio)对人急性髓性白血病细胞株HL-60的增殖抑制作用以及细胞周期变化。结果表明：XTT法检测其24h的半数抑制浓度(IC50)为7．36mg/L．流式细胞仪检测Dio作用24h后，G0/Gl期细胞增多，S期细胞减少，凋亡细胞增多。Dio可明显抑制HL-60细胞的增殖。     

BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的BHK-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展BHK-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。     

MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究

分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库。细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果表明,4个来源的MDCK细胞均呈上皮型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体检测都为阴性;染色体2n=78;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了基础理论依据和细胞资源。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

精原干细胞更新分化的影响因素*

 精原干细胞可以体外培养、冷冻保存、遗传操作及移植，因而在医学、生物学及动物科学方面均有广泛应用前景。根据现有资料阐述一些因素，包括c-Kit受体及其配体SCF、白血病抑制因子（LIF）、维生素A（V_A）、表皮生长因子（EGF）、胶质细胞源神经营养因子（GDNF）、激素和温度，对精原干细胞更新分化的影响。     

牛类胚胎干细胞的分离与克隆

 选用荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎 ,以 PMOL/ L EF细胞为饲养层 ,以 DMEM+ 15 ml/ 10 0 m l NBS+ 0 .1μm ol/L Na2 Se O3+ 0 .1mm ol/ Lβ-巯基乙醇 + 10 ng/ ml IGF+ 10 0 0 IU/ m l L IF为培养液 ,用消化法 ( ICM用 0 .2 5 g/ 10 0 ml胰蛋白酶 + 0 .0 4 g/ 10 0 ml EDTA) ,ES细胞集落用 ( 0 .12 5 g/ 10 0 ml胰蛋白酶 + 0 .0 2 g/ 10 0 m l EDTA)和机械剥离法离散ICM细胞集落和隆起明显的 ES细胞集落为细胞小块 ,获得了 9个传至 6代的牛类 ES细胞系和 2 2个传至 9代的小鼠类 ES细胞系。从形态特征、组织化学染色、核型分析和 ES细胞分化能力等方面对所分离与克隆的细胞进行鉴定 ,证明其具有 ES细胞的诸多特性     

一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法

尝试建立一种简便有效的成年小鼠精原干细胞分离培养及扩增的方法。从单只成年小鼠的睾丸中经过两步酶消化法分离精原干细胞,并在去除间质细胞、纯化后的支持细胞饲养层上培养与扩增,获得稳定增殖的精原干细胞系。此方法可显著提高建系成功率,保证细胞系的单一基因型,显著降低体外培养精原干细胞的成本。为成体基因来源的转基因动物的制作和疾病模型的建立提供技术支持。     

Isolation, Purification and Cryopreservation of Cells from Neonatal Bovine Testis

The development and application of spermatogonial stem cell technology have an important significance in animal cloning, preservation of endangered species and spermatogenesis research. In this study, the seminiferous epithlium cells were isolated and purified, the cells were cryopreserved after identification, and the effects of different purification and cyopreservation methods on bovine testicular cells were studied. The results showed that there were spermatogonial stem cells and sertoli cells in the neonatal bovine seminiferous tubules, differential adherent selection methods could effectively separate these two cell types. Spermatogonial stem cells were positive after AKP, C-kit, and OCT-4 identification; sertoli cells were positive after oil red O and vimentin identification. Frozen stock solution supplemented with 10% DMSO had the best effect in spermatogonial stem cell cryopreservation, while frozen stock solution supplemented with 10% of ethylene glycol and 0.1 mmol·L-1 trehalose had the best effect in sertoli cells cryopreservation.