添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响

研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离和克隆 ;在 ES细胞培养液中 ,犊牛血清体积分数以 15 %～ 2 0 %为宜 ,在 DMEM(L )培养液中添加 0 .1μm ol/ L Na2 Se O3+0 .1mm ol/ Lβ-巯基乙醇 +10 ng/ m L IGF+10 0 0 ng/ m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;低糖 DMEM比TCM199和高糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离。优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在37℃用低体积分数消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高     

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

比较了添加 L IF,IGF- 1和 L IF+IGF对牛胚胎干细胞 (ES)分离的影响。结果表明 :1添加10 ng/m L L IF能提高胚胎贴壁率 ,促进内细胞团 (ICM)和 ES细胞的增殖并抑制其分化 ;2添加 10 ng/m L IGF- 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使 ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;3添加 10 ng/m L L IF+10 ng/m L IGF- 1,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利于牛胚胎干细胞的分离。     

支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3 0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 1 5 % NBS,有利于 MEF和 NBTF的增殖     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中 ,以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层 ,观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为。结果表明 ,牛囊胚一般培养 36～ 6 0 h后孵化脱带 ,96～ 12 0 h后贴壁 ,12 0～ 144 h为ICM传代的最佳时刻。小鼠囊胚一般培养 12～ 2 4h孵化脱带 ,2 4～ 48h贴壁 ,72～ 96 h为传代的最佳时刻。牛胚胎贴附于饲养层上生长 ,极易从饲养层上剥离 ;小鼠胚胎镶嵌在饲养层中 ,滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密。牛ICM色深发黑 ,集落隆起程度较低 ;小鼠 ICM呈暗黄色 ,有呈柱状增殖的趋势。牛滋养层呈网状 ,小鼠滋养层为较致密的单层薄膜     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 ES样细胞集落     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲层，观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为，结果表明，牛囊胚一般培养36－60h后孵化脱带，96－120h后贴壁，120－144h为ICM传代的最佳时刻，小鼠囊胚 般培养12－24h孵化脱带，24－48h贴壁，72－96h为传的最佳时刻牛胚胎贴附于饲养层上生长，极易从饲养层上剥离，小鼠胚胎镶嵌在饲养层中，滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密，牛ICM色深发黑，集落隆起程度较低，小鼠ICM呈暗黄色，有呈柱状增殖的趋势，牛滋养层呈网状，小鼠滋养层为较致密的单层薄膜。     

从早期胚胎分离和培养兔胚胎干细胞

采用昆白系小鼠成纤维细胞（MEF）作为饲养层，低糖DMEM 10%NBS 10%FSC 10ng/mLLIF 10ng/mLSCF 0.1mmol/Lβ-巯基乙醇 100IU/mL青霉青 80IU/mL链霉素作培养基，从培养96h的胚胎中分离出1个兔类ES细胞集落，克隆传至4代，悬浮培养的兔类ES细胞团，可出现囊状胚，兔类ES细胞接种在衰老的饲养层上，出现滋养层细胞和上皮样细胞。     

由猪囊胚内细胞团分离胚胎干细胞的研究

以 PMEF为饲养层培养猪 7～ 9日龄囊胚分离 ES细胞 ,ICM初次传代时间为 4～ 7d,ES细胞传代时间为 4～ 5 d,ES细胞传至 1～ 5代的胚胎数分别为 1 2 (1 8.8% ) ,8(1 2 .5 % ) ,5 (7.8% ) ,3(4 .7% ) ,2 (3.1 % ) ,并进行体外分化和 AKP染色鉴定。对影响猪 ES细胞分离与克隆的因素进行比较 ,结果表明 :(1 ) 9和 1 4日龄小鼠胎儿 PMEF饲养层培养 9日龄猪囊胚 ,贴壁率 (83.3% ,88,9% ) ,ICM形成率 (75 .0 % ,77.8% )和 1代 ES细胞克隆率(2 5 .0 % ,2 2 .2 % )无显著性差异 (P>0 .0 5 )。 (2 ) 7,8和 9日龄胚胎随胚龄增加 ,胚胎贴壁率 (5 .9% ,5 7.1 % ,87,9% )和 ICM形成率 (0 .0 % ,2 8.6 % ,81 .8% )升高 ,差异显著 (P<0 .0 1 )。(3) 9日龄囊胚直径 0 .8～ 1 .2 m m培养36～ 4 8h贴壁 ,贴壁率 1 0 0 % ,ICM形成率 1 0 0 % ;直径 >1 .2 mm囊胚贴壁时间为 4 8～ 72 h,贴壁率 5 7.1 % ,ICM形成率 5 7.1 % ,差异显著 (P<0 .0 5 )。去除直径 >1 .2 m m囊胚部分滋养层细胞培养 36～ 4 8h,贴壁率 91 .7% ,ICM形成率 83.3% ;(4 )添加外源 L IF没有提高贴壁率 (86 .4 % ,90 .9% ;P>0 .0 5 )和 ICM形成率 (81 .8% ,81 .8% ;P>0 .0 5 )     

BRL-CM在昆白小鼠胚胎干细胞分离培养中的应用

目的:探讨Buffalo大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)在昆白小鼠胚胎干细胞(ES)分离培养中的应用。方法:用BRL-CM培养生长在STO(一种小鼠成纤维细胞)饲养层上的昆白小鼠的桑椹胚和囊胚,然后由囊胚内细胞团(ICM)得到ES细胞集落,在有饲养层和无饲养层时用BRL-CM培养分离得到的ES集落。结果:桑椹胚在上述培养条件下能发育成囊胚,然后囊胚在饲养层上长出ICM;用0.1%Trypsin-0.016%EDTA离散ICM,接种到饲养层上培养得到ES集落,ES集落能维持早期传代。结论:在分离培养昆白小鼠的ES细胞时,BRL-CM结合STO饲养层可以用来培养桑椹胚和囊胚,桑椹胚可以发育为囊胚并孵出内细胞团;同时,这种培养条件也能维持昆白小鼠ES细胞的增殖和早期传代。     

Research on Isolation and Clone of Embryonic Stem Cell-Like in Bovine

Bovine embryonic stem cell would be invaluable for researching the aspect of animal cloning, production transgenic animal and discussion of gene function in vitro. With the object of establishing an effective culture system for isolation and clone of bovine pluripotent stem cell, we cultured bovine embryos and mouse embryos including morula blastula and hatached blastula and obtained animal ICM on Primary marine embryonic fibroblast (Primary murine embryonic fibroblast, PMEF) feeder layer with tissue medium(DMEM supplemented with 15ml/100ml NBS ,0.1μmol/L Na2SeO3, 0. 1mmol/L β-mercaptoethanol, 1 000ng/ml LIF,10 ng/ml IGF, 1mmol/L necessary amino acid and 1mmol/L L-glutamine), then, we obtained mouse ICM and bovine ICM. Moreover, we isolated and cloned the 6 passage bovine ES like cells(12 cell lines) and 9 passage marine ES like cells (52 cell lines) deriving from bovine ICM and murine ICM respectively on the feeder layer of PMEF by disaggregating ICM and ES cell clones of bovine and murine into smaller clumps through digesting with 0. 125g/100ml trypsin and 0.02g/100ml EDTA and scattering with a glass needle. The pluripotency of both murine and bovine ES like cells was identified with morphological character, histochemistry identification, karyotype analysis and differentiation of ES cells in vitro or in vivo. This result showed that bovine embryonic stem cell and murine embryonic stem cell had developmental pluripotency.     

大鼠骨髓干细胞的分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的研究

目的探讨大鼠骨髓干细胞的体外分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的的可行性,并检测其表型和功能。方法取大鼠长骨骨髓细胞,第3代细胞传代后加用终质量浓度10μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）的细胞因子,培养3 d后行内皮细胞特异性成分鉴定。结果（1）免疫组化染色鉴定：P3代CD133呈中度阳性表现,CD34呈弱阳性表现;经VEGF诱导后表达明显增强。（2）流式细胞仪细胞计数鉴定：P3代CD133、CD34阳性细胞率分别为97.3%、55.5%;经VEGF诱导后CD133、CD34阳性细胞率分别为91.4%、78.6%。（3）P3代VEGF诱导后乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）、荆豆凝集素（UEA）双染鉴定：经VEGF诱导的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（70.2±5.1）%,未经VEGF诱导后的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（20.4±3.8）%。（4）RealTime-PCR检测第3代VEGF cell和三代cell的内皮细胞特异性成分表达：P3 VEGF cell血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）浓度是P3cell的2.22倍。结论用贴壁筛选法和VEGF细胞因子培养大鼠骨髓干细胞可以获得较高纯度的内皮祖细胞（EPCs）,该细胞具有内皮祖细胞的特性,可用于进一步向内皮细胞分化的研究与应用。     

山羊卵巢间质细胞分离方法的比较

【目的】比较体外条件下不同分离山羊卵巢间质细胞(ovarian interstitial cells)方法的效果。【方法】采用热消化法、冷消化法、单一酶消化法(热消化法,用Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅺ型胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA)及2步酶消化法分离山羊卵巢间质细胞。【结果】热消化法得到的细胞数量较冷消化法多,且试验所用时间缩短,但细胞活率降低。单一酶热消化法中,以1g/LⅪ型胶原酶效果最佳,适合体外培养。2步酶消化法以先胰蛋白酶后Ⅺ型胶原酶组的效果最佳,卵巢组织消化时间及体外培养首次换液时间均较短,适合于体外培养。【结论】采用1g/LⅪ型胶原酶单一酶热消化法或先胰蛋白酶后Ⅺ型胶原酶2步酶消化法,分离山羊卵巢间质细胞的效果均较好,可作为试验用卵巢间质细胞的理想分离方法。     

氨对悬浮培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21)生长代谢的影响

【目的】研究在幼仓鼠肾细胞(BHK-21)悬浮培养过程中,不同浓度氨对其生长代谢的影响。【方法】用添加0,1.8,2.5,5.5,8.0和15.0 mmol/L氨的培养基培养BHK-21细胞,每隔12 h取样1次,用细胞计数仪进行细胞计数,测定细胞活力,采用AO/EB双染色法和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪2种方法检测细胞的凋亡情况,同时测定细胞培养过程中葡萄糖、氨和乳酸浓度的变化。【结果】在BHK-21细胞连续培养过程中,当氨的添加浓度低于1.8 mmol/L时,其对细胞的生长几乎不产生抑制作用,细胞活性、细胞总数与对照组差异不显著,未出现细胞聚集成团现象;当氨添加浓度达到15.0 mmol/L时,BHK-21细胞直接进入死亡期;当氨的添加浓度为2.5~8.0 mmol/L时,氨对细胞生长的抑制作用由弱变强,这种抑制作用在细胞培养至24 h开始出现。另外,随着氨添加浓度的增加,葡萄糖的消耗量减少,细胞代谢产生的乳酸和氨降低。【结论】氨对悬浮培养的BHK-21细胞的生长和代谢有显著影响。     

一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法

尝试建立一种简便有效的成年小鼠精原干细胞分离培养及扩增的方法。从单只成年小鼠的睾丸中经过两步酶消化法分离精原干细胞,并在去除间质细胞、纯化后的支持细胞饲养层上培养与扩增,获得稳定增殖的精原干细胞系。此方法可显著提高建系成功率,保证细胞系的单一基因型,显著降低体外培养精原干细胞的成本。为成体基因来源的转基因动物的制作和疾病模型的建立提供技术支持。     

山羊胚胎心肌细胞分化发育的超微结构研究

利用透射电镜观察了山羊胚胎心肌细胞分化发育过程中超微结构的变化。结果表明 :2 6日龄的山羊胚胎心肌细胞内肌节初步形成。随着胚胎发育 ,心肌细胞的肌节逐步完善 ,心肌细胞内的线粒体数量逐渐增多 ,排列规则 ,线粒体嵴逐渐变密 ,心肌细胞之间的连接也随着胚胎的生长发育逐渐形成和加强 ;2 6日龄山羊胚胎心肌内可见粗面内质网 ;34日龄的山羊胚胎心肌细胞胞浆内可见肌浆网、肌膜下池、横小管和二联管已形成 ;山羊胚胎心肌细胞内糖原颗粒丰富 ,随着胚胎日龄的增长 ,胞质内散布的糖原颗粒呈减少的趋势 ,而肌丝之间的糖原颗粒呈增加趋势 ;2 6日龄的山羊胚胎心房肌内出现少量特殊颗粒     

免疫小鼠脾脏中抗原提呈细胞的快速分离

应用胶原酶消化脾脏、 Ｂ Ｓ Ａ 梯度离心富集低浮密度细胞和 Ｆ Ａ Ｃ Ｓ分选细胞法,自小鼠脾脏中分离出高纯度树突细胞、吞噬细胞和 Ｂ淋巴细胞。分离的 ３ 种细胞样品中分别含 ９７％ 树突细胞、９６％ 吞噬细胞和 ９９％ Ｂ淋巴细胞。而纯化前,树突细胞和吞噬细胞在低浮密度细胞中仅分别占 ６５％ 和 ３５％ , Ｂ 淋巴细胞占脾细胞的 ４２％ 左右。该程序简便、快速、准确,在一个工作日内可制备大量细胞, 并适用于其他淋巴组织中抗原提呈细胞的纯化。     

南方鲶SME－Ⅰ细胞系的建立及其生物学特性的研究

用半消化法和组织块法接种南方鲶晚期胚，经４０多代连续培养，建立了ＳＭＥ－Ⅰ鲶鱼细胞系。该细胞系为贴附性上皮样细胞。细胞内微丝束丰富，平行排列伸到伪足，但质膜下不很密集。细胞最适在含１５％～２０％小平血清的１６４０培养基中生长，适温２８～２９℃，ｐＨ６．５～７．２，群体倍增时间为５８．６ｈ，已增殖到１０￣８个的水平。细胞染色体数为正常二倍体２ｎ＝５８，但有不少异倍化细胞。该细胞系已可用于鱼类生物工程研究和进入细胞资源库保存。     

鱼类干细胞育种技术回顾与展望

鱼类是优质动物蛋白的重要来源,其中养殖鱼类占重要地位,而通过选择育种、杂交育种等传统方法和分子辅助育种、基因编辑等新技术培育优良品种是鱼类养殖业健康持续发展的关键.近年来,鱼类干细胞技术特别是细胞移植和诱导技术快速发展,为鱼类优良品种培育提供了新的技术途径.介绍了鱼类干细胞育种的现状及应用,总结了鱼类干细胞育种技术面临...     

仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。     

亚硒酸钠对人早幼粒白血病细胞（HL－60）的影响

以人早幼粒白血病细胞（ＨＬ－６０）为实验对象，研究了亚硒酸钠对细胞的影响。结果发现５．８μｍｏｌ／Ｌ亚硒酸钠可以抑制ＨＬ－６０细胞生长，但１１．６μｍｏｌ／Ｌ以上浓度时对细胞的毒性加重。未发现亚硒酸钠能诱导ＨＬ－６０细胞进行形态和功能分化。