精原干细胞体外分离培养的研究进展

为探索提高精原干细胞分离和体外培养效率的技术方法,以建立长期稳定的动物精原干细胞培养体系,对动物精原干细胞的分离纯化和体外培养的研究进展进行综述。以"Spermatogonial stem cell,Isolation,Culture,Enrichment,in vitro"和"精原干细胞、分离、培养和体外扩增"为检索词,查阅精原干细胞相关文献,并进行归纳整理。精原干细胞分离主要有机械分离法和酶消化法,纯化精原干细胞的方法有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞法等,目前大动物精原干细胞的富集常使用酶消化法、差速贴壁法和Percoll梯度离心法相结合。精原干细胞体外培养需模拟体内生境,通常在基础培养基中添加血清、饲养层细胞和各类生长因子等,培养条件会影响精原干细胞培养的效果。小鼠精原干细胞已建立较完善的培养体系,而人和多数大动物还缺乏完善的精原干细胞体外培养体系。     

翘嘴红鲌精原干细胞的分离培养及鉴定

通过制作、观察翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)各生长阶段的精巢切片,确定翘嘴红鲌精原干细胞最佳分离时间。采用两步酶消化法分离其精原干细胞,并进行体外初步培养研究,最后通过碱性磷酸酶染色、干细胞标志基因Oct-4 RT-PCR扩增进行鉴定。结果显示:7月龄翘嘴红鲌精巢为分离精原干细胞的最佳时期,所分离的精原干细胞符合干细胞的形态、增殖及表达特征,且细胞碱性磷酸酶染色呈阳性,支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性,Oct-4基因表达呈阳性。     

雄性多能性生殖干细胞及其应用于制作转基因动物的潜能

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性动物体内唯一可以将遗传信息遗传给后代的成体干细胞,具有自我更新和分化为精子的能力.对于小鼠而言,随着精原干细胞体外培养体系的逐渐建立和完善,人们不仅对精原干细胞自身的增殖和分化调节机制有了较深入的了解,同时也发现了精原干细胞在再生医学和转基因动物领域具有其独有的优越性,目前的研究结果已经可以通过安全的途径将小鼠精原干细胞诱导转变为和胚胎干细胞功能相似的多能性干细胞,同时也实现了通过异体移植精原干细胞的方式来制作转基因小鼠和大鼠.这些研究结果让人们看到了精原干细胞对人类再生医学和制作大型转基因动物具有巨大的应用潜力.本文将对通过诱导精原干细胞获得的多能性干细胞的研究现状及其用于制作大型转基因动物所面临的问题和可能的解决途径加以概述和总结.     

枸杞多糖对小鼠精原干细胞增殖作用的影响

[目的]观察枸杞多糖(LBP)对体外培养的小鼠精原干细胞的增殖作用。[方法]选2～5日龄的ICR小鼠,采用多次贴壁法纯化精原干细胞培养3 d,加入不同浓度的LBP,利用MTT比色分析法和Brdu增殖细胞标记法,检测不同浓度LBP对体外培养精原干细胞增殖的影响。[结果]与对照相比,用LBP处理后的精原干细胞的细胞数量明显增多,高浓度的LBP(200μg/ml)对精原干细胞的增殖有明显的促进作用(P<0.01)。[结论]LBP能够促进精原干细胞的增殖。     

新生牛与成年牛骨髓间充质干细胞的生物学特性比较

 【目的】建立体外分离、培养和扩增牛骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法,研究牛龄对BMSCs增殖特性的影响。【方法】用贴壁筛选法纯化新生牛与成年牛的BMSCs,传代扩增,测定生长曲线和贴壁率,并进行形态学观察。【结果】通过体外培养,可使体内环境下低丰度的BMSCs实现扩增。新生牛BMSCs易于分离纯化,贴壁率及增殖能力显著高于成年牛。【结论】新生牛比成年牛更适于BMSCs的提取。BMSCs的增殖生长特性与年龄密切相关,增殖能力和活性随着年龄的增加而降低,成功地建立了一种分离培养牛BMSCs的方法,分析了BMSCs部分生物学特性,为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下基础。     

通过可调控Lhx2的表达制备小鼠造血干细胞系

【目的】研究一种永生化小鼠造血干细胞系的制备方法。【方法】通过添加Doxycycline来诱导Lhx2基因在成年骨髓的血液祖细胞/干细胞中表达,获得造血干细胞系。而在这些永生化的造血干细胞移植前,撤销Doxycycline,终止Lhx2基因的表达。【结果】永生化的造血干细胞系和原代造血干细胞一样,能在受体小鼠骨髓中增殖,并在外周分化为T细胞、B细胞和髓系细胞。Lhx2的异位表达可能会改变这些细胞以降低其在体内的适应性。【结论】本研究通过条件性表达Lhx2获得的永生化造血干细胞系与成年小鼠骨髓中的原代造血干细胞相比,具有相似的表面标志物,从而证明Lineage~-Sca-1~+c-kit~+,永生化的造血干细胞系极易扩增,可以获得大量均一的细胞群体。     

精原干细胞体外培养体系的建立

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性哺乳动物精子发生及具有生育能力的保障。精原干细胞的体外培养不仅为精子发生的研究提供材料,还有助于开发新的家畜保种方法和动物遗传修饰。为了探索猪精原干细胞体外培养体系的建立方法,本研究采用胶原酶Ⅳ-胰酶两步酶法对3~7日龄大白仔猪睾丸进行消化得到单细胞悬液,利用不同时间程序的差速贴壁对精原干细胞进行纯化,选择大白仔猪睾丸支持细胞作为饲养层,添加不同细胞因子研究精原干细胞的增殖情况以期得到最佳的培养体系。结果显示,通过差速贴壁得到的UCHL-1阳性生殖细胞比例最高为18.59%±0.94%;不同细胞因子组合添加试验发现精原干细胞添加20 ng·mL^-1 GDNF、10 ng·mL^-1 IGF和20 ng·mL^-1 bFGF的增殖效果最佳;以支持细胞作为饲养层、在DMEM/F12中添加1%FBS以及上述细胞因子组合对精原干细胞进行培养15 d后可见大量的精原干细胞集落,通过免疫荧光、AKP染色、荧光定量PCR等试验证明精原干细胞进行了大量增殖。本研究初步建立了猪精原干细胞的体外培养体系,可通过体外培养大量增殖精原干细胞,为后续精原干细胞的研究奠定基础。     

温度及BRL饲细胞对体外小鼠精原干细胞的影响

 将6 日龄小鼠生精上皮单细胞分别接种于BRL和STO饲养层上,于32 ℃或37 ℃培养,研究其对精原干细胞的影响。结果:在培养的第1周内,2个及4个相连的精原细胞合胞体明显增多。培养１周后,多数精原细胞经短暂的存活及分裂活动后退化消失,培养体系中仅保留下少量单个及由细胞间桥相连的双个及4个成串或成团的A型精原细胞。这些细胞在随后的培养过程中,不表现明显的分裂活动,呈碱性磷酸酶阳性反应。根据精原干细胞生物学特性,它们极有可能就是精原干细胞及其子代细胞。不同条件培养体系中的精原干细胞的生物学行为无明显不同,培养60 d时均仅有少量精原干细胞存活。结论: BRL细胞能用作饲养层促进精原干细胞存活,但对其更新性增殖没有明显作用;32～37 ℃对精原干细胞的生物学行为无明显影响,均可用于培养精原干细胞。     

牛精原干细胞研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性生殖系干细胞,位于睾丸曲细精管基膜上,既具有自我更新潜能,又具有定向分化潜能,是自然状态下出生后动物体内在整个生命过程中进行自我更新并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞。根据国内外最新相关进展,系统评述了牛SSCs的生物学特性、分离纯化、冷冻保存、体外培养、永生细胞系的建立及移植等方面的现状及问题。     

小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化

目的:探讨小鼠胚胎中脑分离神经干细胞的体外培养方法,以获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供试验材料。方法:无菌条件下分离孕12~13 d小鼠胚胎中脑曲,制成单细胞悬液,碱性成纤维生长因子(bFGF)和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及子代细胞的分化方向,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化并经流式细胞仪检测自然分化为多巴胺能神经元的比例为3.25%。结论:小鼠胚脑中脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。     

Isolation, Purification and Cryopreservation of Cells from Neonatal Bovine Testis

The development and application of spermatogonial stem cell technology have an important significance in animal cloning, preservation of endangered species and spermatogenesis research. In this study, the seminiferous epithlium cells were isolated and purified, the cells were cryopreserved after identification, and the effects of different purification and cyopreservation methods on bovine testicular cells were studied. The results showed that there were spermatogonial stem cells and sertoli cells in the neonatal bovine seminiferous tubules, differential adherent selection methods could effectively separate these two cell types. Spermatogonial stem cells were positive after AKP, C-kit, and OCT-4 identification; sertoli cells were positive after oil red O and vimentin identification. Frozen stock solution supplemented with 10% DMSO had the best effect in spermatogonial stem cell cryopreservation, while frozen stock solution supplemented with 10% of ethylene glycol and 0.1 mmol·L-1 trehalose had the best effect in sertoli cells cryopreservation.     

Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line

Spermatogenesis is the process by which spermatogonial stem cells divide and differentiate to produce sperm. In vitro sperm production has been difficult to achieve because of the lack of a culture system to maintain viable spermatogonia for long periods of time. Here we report the in vitro generation of spermatocytes and spermatids from telomerase-immortalized mouse type A spermatogonial cells in the presence of stem cell factor. This differentiation can occur in the absence of supportive cells. The immortalized spermatogonial cell line may serve as a powerful tool in elucidating the molecular mechanisms of spermatogenesis. Furthermore, through genomic modification and transplantation techniques, this male germ cell line may be used to generate transgenic mice and to develop germ cell gene therapy.     

Production of Transgenic Animals Using Spermatogonial Stem Cells

Spermatogonial stem cells (SSCs) are a type of adult stem cell found in male mammals. These cells have the capacity for self renewal and are capable of differentiating in the niche of testis. They are also the only adult stem cells in a normal postnatal body that undergo self-renewal throughout life, transferring genetic information to the offspring. Since a technique for transplanting SSCs was first described by Brinster and his colleagues in 1994, more and more researchers have become interested in exploring the possibility of utilizing adult SSCs to generate transgenic animals. In this minireview, we attempt to summarize the current research progress in the area of spermatogonial stem cells including the source, types and differentiation of the SSCs, and the application on transgenic animals, with a particular focus on the strategy of SSCs delivery including seminiferous tubule injection and spermatogonial stem cell transplantation.     

山羊小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,至10代山羊小肠上皮细胞质变大,细胞几乎无法增殖,细胞开始凋亡。综上所述,采用组织块接种能够获得山羊小肠上皮细胞并正常传至第10代,可为研究山羊小肠上皮细胞营养物质吸收和调控机理提供细胞素材。     

麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,采用组织块贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法,从麦洼牦牛乳腺组织中成功分离并获得纯化的乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力等生物学特性的检测,建立并鉴定麦洼牦牛乳腺上皮细胞系。结果显示,乳腺细胞形态良好,细胞接种存活率达91%,群体倍增时间26.97h,细胞生长曲线呈典型"S"型,细胞传至25代以上仍保持旺盛的增殖活力。可见,通过对细胞传代及反复冻存和复苏已成功建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞系,获得大量的乳腺上皮细胞,使麦洼牦牛物种在细胞水平上得以保存,为建立牦牛乳腺生物反应器及泌乳调控机制研究提供基础。     

内在调节蛋白及生长因子对精原干细胞增殖与分化的调控

文章阐述了在转录水平上精原干细胞在增殖与分化过程中的内在调节蛋白Plzf、Sohlh及其对精原干细胞的调节机制。介绍了胶质细胞源性神经营养因子、干细胞因子、Ets相关分子、骨形态发生蛋白、肝细胞生长因子、斯里兰卡肉桂碱受体等由支持细胞分泌的对精原细胞增殖与分化有重要作用的生长因子。