干细胞因子对小鼠附植前胚胎体外发育的影响

为优化胚胎体外培养体系,提高胚胎体外培养发育率和发育质量,以昆明小鼠体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚为研究对象,研究不同浓度干细胞因子对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响。结果表明:在KSOM培养液中,小鼠自然受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚的卵裂率和桑椹胚率均无显著差异(P0.05),但IVN胚和IVF胚的囊胚发育率及囊胚细胞总数显著高于孤雌激活胚;培养液中添加不同浓度的干细胞因子对小鼠自然受精胚和孤雌激活胚的卵裂率、桑椹胚率、囊胚发育率和囊胚细胞总数都没有显著的影响(P0.05),但干细胞因子浓度为100ng·mL-1时,小鼠体外受精胚的桑椹胚率和囊胚发育率显著高于对照(P0.05)。     

程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率.     

不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响

在TYH受精液中添加促卵泡素（FSH）和苯甲酸雌二醇（E2），检测不同浓度的FSH和E2对昆明小鼠的体外受精率的影响；检测在M16、CZB两种培养液中添加胎牛血清（FCS）与否对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响．结果表明：在．rYH中添加1．0IU／mL FSH，受精率和2-细胞胚率显著高于对照组；在TYH中添加0．1μg／mL E2，受精率和2-细胞胚率也显著高于对照组．在CZB中添加体积分数为10％FCS，可显著减少2一细胞期体外发育阻断，并显著提高小鼠胚胎体外发育的囊胚率，可见，以TYH添加1．0IU／mL FSH和0．1μg／mL E2为受精液，以含体积分数为10％FCS的CZB为胚胎培养液，小鼠胚胎可获得较高的囊胚率．葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的．     

肉苁蓉及淫羊藿对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究肉苁蓉及淫羊藿对小鼠早期胚胎体外发育的影响.试验选取6～8周龄昆明小鼠早期胚胎,以不添加中药培养液组为空白对照,分以下试验组:Ⅰ组:早期胚胎在纯培养液M16+5％FBS( M1)与M16+5％FBS+EDTA+牛磺酸(M2)中的体外发育情况;Ⅱ组:早期胚胎添加至中药体积浓度为0.1％的M1与M2培养液中.Ⅲ组:早期...     

不同发育时期鼠胚对一步细管内冷冻一解冻耐受性的研究

本试验采用一步添加防冻剂（１０％甘油）、１２．５％蔗糖一步细管内脱除甘油，３７℃温水快速解冻法，对３９３枚处于不同发育时期的优良胚胎做了冷冻研究，旨在探索不同发育时期的胚胎对一步细管内冷冻解冻耐受性存在的差异，为哺乳动物胚胎冷冻和移植提供资料。解冻后体外培养结果表明，晚期桑椹胚（包括致密桑椹胚和致密后桑椹胚两个阶段）的抗冻能力最强，体外发育率致密桑椹胚为８０．０％（３２／４０）、致密后桑椹胚为７８．０％（３２／４１）；早期桑椹胚和早期囊胚次之，体外发育率为６２．２％（２８／４５）和６６．１％（３９／５９）；囊胚和扩展囊胚的抗冻能力最低，体外发育率仅为５１．６％（３１／６０）和５４．５％（１８／３３）。     

小鼠二分胚发育的观察

本试验用含5％灭活羊血清的PBS为冲卵液,冲出小鼠胚胎,选择质量好的晚期桑椹胚和早期囊胚,保存在含20％天活羊血清的PBS中,然后在立体显微镜下分割胚胎。共分割174枚小鼠胚胎,分割成功率为87.4(258/294),将218枚小胚二分胚体外培养20小时,发育到优秀囊胚率为65.5％(143/218),出现假囊胚率为18,3％(40/218),出现滋养外胚层囊及非整合型的胚胎率为16,1％(35/218)。     

小鼠卵母细胞和早期胚胎端粒酶活性的测定

为了解小鼠早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法(TRAP)进行了小鼠卵母细胞和附植前胚胎端粒酶活性的测定。结果表明,小鼠卵母细胞、桑椹胚和囊胚为端粒酶阳性,而2-细胞和8-细胞为阴性。依据电泳条带在成像系统下的光密度,计算相对总产品产量(TPG)的定量比较发现,囊胚端粒酶活性最高,为269.331;桑椹胚次之,为96.231;卵母细胞最低,为85.782。小鼠桑椹胚和囊胚胚胎记数及单细胞端粒酶活性比较结果显示,囊胚单细胞TPG最低,为3.45;桑椹胚单细胞略高于囊胚,为4.00;而卵母细胞最高,为85.782,大约是囊胚细胞的25倍。     

小鼠桑椹胚OPS管内解冻和直接移植

本实验对昆明白系小鼠的桑椹胚实施OPS法玻璃化冷冻,研究不同管内解冻程序对胚胎体内外发育的影响,旨在为小家畜胚胎冷冻、解冻和移植提供技术参数。采用OPS冷冻两步法(10%(体积分数)EG 10%(体积分数)DMSO溶液中平衡30 s,移入EDFS30平衡25 s)保存小鼠桑椹胚。一步法解冻是将OPS直接插到盛有0.5mol/L蔗糖的离心管中分别平衡1、2、3、4、5和6 min,解冻后经体外培养结果表明,平衡2~4 min组囊胚发育率(93.58%~97.22%)与对照组(100%)无显著差异(P>0 05);实施两步法解冻时将OPS先后插入0.5和0.25mol/L蔗糖中,体外培养结果显示,先后平衡3和2 min组囊胚发育率(100%)最佳,同对照组无显著差异(P>0.05)。将以上方法管内解冻最佳组的胚胎用OPS管作移植导管,直接移植到受体子宫角中,其妊娠产仔率(38.57%)和管外解冻组(42.86%)及新鲜对照组(51.19%)均无显著性差异(P>0.05)。证明OPS玻璃化冷冻的小鼠桑椹胚可以进行管内解冻和直接移植,为小家畜胚胎移植提供了模型。     

不同浓度的FBS和hLIF对小鼠原核期受精卵体外发育率的影响

通过在mM16培养液中添加不同浓度的FBS及hLIF,探讨小鼠原核期受精卵的体外培养条件,旨在建立稳定的小鼠原核期受精卵的体外培养系统。实验结果表明:在mM16中添加10%或15%的FBS都可降低胚胎在体外的发育率,其体外囊胚发育率与对照组mM16(未加血清组)差异显著(73.3%对32.6%;73.3%对35.8%);5001、0001、500 IU/ml 3种不同浓度的hLIF都可提高小鼠受精卵体外发育率,三者之间差异不显著,但以添加1 000 IU/ml hLIF组中,桑椹胚/囊胚率及囊胚脱出率为最高。结论:在mM16中添加血清不能有效地支持小鼠受精卵在体外的发育,添加1 000 IU/ml hLIF能够很好地支持小鼠受精卵的体外发育。     

活性氧(ROS)对小鼠胚胎分裂指数的影响

小鼠体内发育的桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和从1-细胞期取出在CZB培养液中培养的桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚的分裂指数分别为5．85，4．64，2．16，4．96和6．25，508，2．77，3．03．经统计分析，体内与体外CZB培养的胚胎分裂指数无显著差异，说明体内发育的胚胎和体外CZB培养胚胎的有丝分裂增殖能力没有差异．体外CZB培养的不同时期添加H2O2的胚胎，发育至桑椹胚、早期囊胚、扩张囊胚阶段，制作胚胎标本，胚胎的分裂指数显示：扩张囊胚的0～72h组的分裂指数与0～12h，24～36h组有显著差异（P〈0．05），而与其它各发育阶段的各组分裂指数均无差异，说明经H2O2处理之后存活下来的胚胎与正常体外发育胚胎的有丝分裂增殖能力没有差异．     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

GSH和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究活性氧(ROS)-过氧化氢和抗氧化剂-还原型谷胱甘肽(GSH)对小鼠2-细胞期胚胎体外发育的影响.用含有不同浓度H2O2的mSOF液培养小鼠胚胎,从H2O2浓度0.14 mg/L组开始的囊胚发育率显著低于对照组和其它组(P0.05);以mSOF液为基础液,在添加0.14 mg/L H2O2的基础上分别添加不同浓度的GSH,阳性对照组的囊胚发育率显著高于阴性对照组(P0.05);在添加外源性H2O2(0.14 mg/L)的情况下,随着GSH浓度的增加其囊胚发育率也显著增加.结果表明,H2O2可诱导小鼠2-细胞期胚胎体外发育的阻滞,GSH可阻止H2O2对小鼠2-细胞期胚胎的抑制效果.     

激素对小鼠胚胎体外发育的影响

探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。     

体外培养山羊早期胚胎基因表达的研究

用单胚构建的mRNA差异显示技术,对体外培养的山羊早期2、4、8～16细胞期胚胎的基因表达进行研究,并选择1条在8～16细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明：该片段与牛NADH脱氢酶1a亚复合体4基因具有97％的同源性。该基因影响细胞内ATP的合成,可能与羊早期体外培养胚胎的正常发育有关。     

FCS和BSA对小鼠早期胚胎体外培养的影响

本实验是在CZB和Whitten’s Medium 2种培养液中添加胎牛血清(FCS)和牛血清白蛋白(BSA),比较它们对小白鼠早期胚胎体外发育的影响。结果如下:在培养注射HCG后37～39h的小鼠胚胎时,添加FCS的CZB培养液中通过发育阻断期的胚胎和发育到囊胚的胚胎均明显高于添加BSA的CZB培养液(80.9%、64.3%和41.7%、29.6%),差异显著(P0.05);当用上述液培养注射HCG后44h的小鼠胚胎时,不管是进口培养皿还是国产培养皿,胚胎发育率的差异均不显著(P0.05);在用CZB和Whitten’s培养液分别添加FCS和BSA后,培养注射HCG后44h2-细胞小鼠胚胎时,不论添加FCS还是BSA,在CZB培养液中胚胎发育率均高于Whitten’s培养液(P0.05),但添加FCS和BSA之间的差异不显著(P0.05)。     

用酶分离小鼠早期胚胎的研究

用酶分离小白鼠２－－细胞、４－－细胞和８－－细胞胚胎，获取单个卵裂球，将其培养在含有牛血清蛋白质的ＣＺＢ培养基微滴内。培养的小白鼠胚胎发育情况有３种：（１）正常发育；（２）泡囊化；（３）不发育。在体外培养条件下２－－细胞单个卵裂球有８６．５％发育成２－－细胞；有３５．１％发育成４－－细胞，有８．１％发育到８－－细胞，有５．４％发育到桑椹胚；４－－细胞胚的单个卵裂球中有８３．３％发育到２－－细胞，３７．５％发育到４－－细胞，１２．５％发育到８－－细胞，８．３％发育到桑椹胚；在８－－细胞胚的单个卵裂球中有４６．７％发育到２－－细胞，２６．７％发育到４－－细胞，１３．３％发育到８－－细胞、６．７％发育到桑椹胚。实验结果表明用酶分离小白鼠早期胚胎，所获卵裂球具有一定的继续发育能力，而且没有透明带也能发育。     

牛输卵管蛋白对小鼠原核胚体外发育的影响

本实验通过添加１～４ｍｇ／ｍｌ牛输卵管蛋白至ＴＣＭ－１９９培养液中，对小鼠原核胚进行体外培养，观察原核胚的分裂和发育情况。小鼠原核胚很少分裂，远低于对照组原核胚分裂和发育水平。牛输卵管蛋白对小鼠原核胚的发育起明显的抑制作用，同时这种抑制作用随牛输卵管蛋白浓度的降低．似乎有减轻的趋势，表明牛输卵管蛋白中，存在抑制小鼠胚胎分裂和发育的蛋白质，对小鼠原核胚的抑制作用具有剂量效应。     

对昆明白杂种鼠胚胎体外培养的实验研究──2细胞期至卵圆筒期

利用ＣＭＲＬ—１０６６和国产其它药品对昆明白杂种小鼠２—细胞期的胚胎，进行了体外培养试脸，成功地将２—细胞胚胎在体外培养条体下，使之生长发育到卵圆筒阶段。从２—细胞期开始计算，囊胚形成率为７０％，卵化率为３０％，附植率为２％，卵圆筒期胚胎形成率为１％。试验发现，把２—细胞期小鼠胚胎体外培养到卵圆筒期比体外发育到同阶段推迟１～２天，此卵圆筒期胚胎的形成率与国外报道的２４％相比仍然很低，其原因估计可能为：１）小鼠的品种；２）国产药物的纯度；３）ＣＯ２条件不同而造成。     

小鼠早期胚胎体外培养的实验研究

本试验采用国产化学试药和哈尔滨地区的天然水,制备了 Brinster 化学合成培养液。把160枚通过超数排卵获得的2-细胞期小鼠胚胎放在添加适量牛血清白蛋白或胎牛血清的 Brinster 化学合成培养液内,并在适当湿度、5%CO_2和95%空气的气相环境、37℃温度条件下培养。58小时后,大约67%4小鼠2-细胞期胚胎发育到桑椹胚阶段;大约32%的小鼠桑椹胚发育到囊胚期阶段。试验证明,用国产化学药品和哈尔滨地区水配制的培养液可以对早期小鼠胚胎进行体外培养研究。     

小鼠附植前胚胎培养基的优化

从4种常用培养基M16、MTF、CZB、KSOM中筛选适合CD-1小鼠附植前胚胎发育的体外培养基,并分析磷酸二氢钾、乳酸钠、葡萄糖、牛磺酸以及必需与非必需氨基酸对CD-1小鼠胚胎体外培养的影响。发现KSOM的培养效果明显优于其他培养基。在KSOM中添加必需氨基酸对8-细胞以前的胚胎发育有抑制作用,但添加牛磺酸、必需氨基酸与非必需氨基酸都可提高囊胚的细胞数。优化后的分阶段KSOM培养基显著提高了早期胚胎的囊胚发育率和囊胚期细胞数目。