化学培养液对小鼠原核胚体外发育的影响

本试验用０．１ｍＬ培养液在３７℃，５％ＣＯ２条件下培养昆明小鼠原核胚。结果表明，用ｍＳＯＦ和ＰＬ３培养小鼠原核胚，４－细胞发育率分别为１０％和７７％。以后停止发育；ＰＬ３和ＰＬ３培养小鼠原核胚，每２４ｈ换１次培养液，结果发育到桑椹胚和囊胚的百分离分别是２７．５％和３８．５％；用ｍＭＴＦ，ｍＭＴＦ＋２０ＡＡ，ｍＭＴＦ＋Ｎｏｎ＋Ｇｌｎ，ｍＭＴＦ＋Ｎｏｎ，ｍＭＴＦ＋Ｅｓｓ＋Ｇｌｎ培养小鼠原核胚，发育率分     

新鲜山羊输卵管液对体细胞克隆和转基因胚胎体外发育的影响

用添加不同浓度发情期山羊输卵管液的培养基,对正常单细胞受精卵、注射外源基因后受精卵和细胞核移植后山羊重构卵进行体外培养,探讨其对胚胎体外发育的影响。结果表明:添加20%输卵管液后正常受精卵桑椹胚分裂率为26.1%(11/42),极显著(P<0.01)高于对照组(未添加输卵管液)(7.6%)、50%输卵管液组(4.7%)和100%输卵管液组(0);添加20%输卵管液后,体外培养显微注射转基因受精卵有20.0%(8/40)发育至16-细胞,极显著(P<0.01)高于对照组(6.7%)和50%输卵管液组(4.8%);细胞核移植重构卵在含20%输卵管液的培养基中桑椹胚分裂率为7.3%,与体内培养桑椹胚分裂率(11.1%)差异不显著。在体外培养条件下,添加20%输卵管液可明显提高正常受精卵、转基因受精卵和克隆重构卵的分裂率和发育率。     

山羊转基因克隆胚在体内和体外发育的研究

探讨了体内/外成熟卵母细胞、体内/外培养系统、输卵管液和输卵管上皮细胞共培养系统对转基因克隆胚发育的影响。结果表明:体内/外成熟卵母细胞对转基因克隆胚各阶段发育率无显著影响。体内/外培养系统中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率差异不显著;16-细胞和桑/囊胚发育率差异显著。对照组和20%输卵管液中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率均显著高于50%输卵管液;在20%输卵管液中16-细胞的发育率显著高于对照组和50%输卵管液。转基因克隆胚在输卵管上皮细胞共培养系统和SOF培养系统中培养,2～3-细胞和4-细胞发育率无显著差异;8-细胞、16-细胞和桑/囊胚的发育率差异显著。     

活性氧(ROS)对小鼠胚胎分裂指数的影响

小鼠体内发育的桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和从1-细胞期取出在CZB培养液中培养的桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚的分裂指数分别为5．85，4．64，2．16，4．96和6．25，508，2．77，3．03．经统计分析，体内与体外CZB培养的胚胎分裂指数无显著差异，说明体内发育的胚胎和体外CZB培养胚胎的有丝分裂增殖能力没有差异．体外CZB培养的不同时期添加H2O2的胚胎，发育至桑椹胚、早期囊胚、扩张囊胚阶段，制作胚胎标本，胚胎的分裂指数显示：扩张囊胚的0～72h组的分裂指数与0～12h，24～36h组有显著差异（P〈0．05），而与其它各发育阶段的各组分裂指数均无差异，说明经H2O2处理之后存活下来的胚胎与正常体外发育胚胎的有丝分裂增殖能力没有差异．     

不同浓度的FBS和hLIF对小鼠原核期受精卵体外发育率的影响

通过在mM16培养液中添加不同浓度的FBS及hLIF,探讨小鼠原核期受精卵的体外培养条件,旨在建立稳定的小鼠原核期受精卵的体外培养系统。实验结果表明:在mM16中添加10%或15%的FBS都可降低胚胎在体外的发育率,其体外囊胚发育率与对照组mM16(未加血清组)差异显著(73.3%对32.6%;73.3%对35.8%);5001、0001、500 IU/ml 3种不同浓度的hLIF都可提高小鼠受精卵体外发育率,三者之间差异不显著,但以添加1 000 IU/ml hLIF组中,桑椹胚/囊胚率及囊胚脱出率为最高。结论:在mM16中添加血清不能有效地支持小鼠受精卵在体外的发育,添加1 000 IU/ml hLIF能够很好地支持小鼠受精卵的体外发育。     

激素对小鼠胚胎体外发育的影响

探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。     

干细胞因子对小鼠附植前胚胎体外发育的影响

为优化胚胎体外培养体系,提高胚胎体外培养发育率和发育质量,以昆明小鼠体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚为研究对象,研究不同浓度干细胞因子对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响。结果表明:在KSOM培养液中,小鼠自然受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚的卵裂率和桑椹胚率均无显著差异(P0.05),但IVN胚和IVF胚的囊胚发育率及囊胚细胞总数显著高于孤雌激活胚;培养液中添加不同浓度的干细胞因子对小鼠自然受精胚和孤雌激活胚的卵裂率、桑椹胚率、囊胚发育率和囊胚细胞总数都没有显著的影响(P0.05),但干细胞因子浓度为100ng·mL-1时,小鼠体外受精胚的桑椹胚率和囊胚发育率显著高于对照(P0.05)。     

用KOSR优化山羊克隆胚的培养体系

体细胞核移植重构胚的体外培养一直是影响山羊克隆效率的一个重要因素,为了排除成分复杂的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)对克隆重构胚发育的潜在抑制作用,本研究采用成分明确的血清替代品(knockout serum replacement,KOSR)进行山羊体细胞克隆重构胚胎的体外培养,并比较KOSR与FBS对重构胚的发育效率的影响。结果显示,KOSR组山羊重构胚培养体系的分裂率明显高于FBS组(80.67±0.63%.vs 49.02±4.85%,P<0.01),2组在重构胚重编程过程中的8细胞率具有显著差异(48.89±1.92%vs.28.59±3.13%,P<0.05);2组不同培养体系的受孕率也有明显不同(33.3%vs.10%,P<0.05)。研究结果表明,KOSR培养体系能有效提高山羊重构胚的发育效率,特别是有利于重构胚的早期重编程,为获得健康的转基因克隆山羊奠定了良好的基础。     

显微注射导入生长激素基因产生转基因兔和鼠

本研究旨在建立显微注射转基因系统；获得表达人生长激素和猪生长激素基因的转基因兔和鼠；探索提高动物生长性能的可能性与可行性。家兔和小鼠作超数排卵和交配处理，收集原核胚。将小鼠金属巯因启动子与人生长激素和绵羊金属巯因启动子与猪生长激素融合的基因质粒注入雄原核，观察体外和体内发育结果。用斑点杂交、ＰＣＲ技术和放射免疫检测外源基因的整合和表达情况。试验结果，胚胎回收后立即作体外培养的囊胚发育率为９０％，基     

牛胚胎在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的生长行为

 比较了牛胚胎与小鼠胚胎在体外培养过程中的生长行为，结果表明，牛滋养层细胞与内细胞团（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌｍａｓｓ，简称ＩＣＭ）连接不紧密，其迅速增殖，形成半透明囊腔结构；小鼠胚胎滋养层与ＩＣＭ密切相连，形成盘状结构，并推移原代小鼠胎儿成纤维细胞（Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＰＭＥＦ）饲养层。牛ＩＣＭ形态呈现多样性，表现为团状、条状、网状和混合型；小鼠ＩＣＭ形态单一，多呈圆盘状。体外培养的牛胚胎发育速度比小鼠胚胎迟缓，牛ＩＣＭ初次传代时间为胚胎体外培养开始后５～６ｄ，小鼠ＩＣＭ初次传代时间为胚胎体外培养后３～４ｄ。牛ＩＣＭ分化程度由小到大依次为团状ＩＣＭ、条状ＩＣＭ、混合型正 和网状ＩＣＭ。牛和小鼠胚胎附着率及ＩＣＭ克隆率由大到小均依次为孵化胚、囊胚和桑褡胚，但桑褡胚和囊胚附着率和ＩＣＭ克隆率均无显著差异（Ｐ＞０．０５）。与全胚相比较，牛和小鼠裸胚（无透明带或透明带不完整的胚胎）贴壁时间提前，但ＩＣＭ形成率和ＩＣＭ的生长行为均无显著差异；小鼠和牛桑椹胚卵裂球（中、晚期）体外分化抑制培养，形成亚囊胚而不能获得 ＥＳ细胞；剥离牛胚胎滋胚层细胞，ＩＣＭ细胞更易分化。     

KSOM无血清培养液在绵羊胚胎体外培养应用的研究

本文利用KSOM、TCM-199+20％人血清和KSOM+20％人血清培养绵羊体外受精胚胎,以研究KSOM作为绵羊胚胎体外培养无血清培养液的可能性。实验结果说明,KSOM支持绵羊胚胎早期发育至囊胚期,而在KSOM中添加血清后,胚胎可发育至孵化囊胚,而且孵化囊胚率高于常用的TCM-199+血清(24％vs 7％)(p<0.05)。说明KSOM可以用于绵羊胚胎早期发育的无血清培养液。     

HA对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的研究

在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P<0.05),表明HA在卵母细胞无血清成熟培养中可代替BSA。在受精卵体外培养液(TCM-199-c)中添加HA时,囊胚发育率与对照组(BSA)差异不显著(P>0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-c组(P<0.05),表明HA对牛胚胎体外发育具有明显的促进作用,在无血清培养中可以代替BSA。当在TCM-199-c+HA中添加少量的BSA时,囊胚发育率(31.19%)显著高于其他各组(P<0.05),表明HA欲完全代替BSA还有不完善之处,有待进一步研究。     

昆明小鼠单细胞胚胎体外培养的研究

本试验研究了葡萄糖、EDTA和小鼠血清对昆明小鼠单细胞胚体外发育的影响.结果发现:不含葡萄糖HECM-1组桑椹率为40.05％,对照组为8.14％;含EDTA的CZB组桑椹率为61.18％,对照组为47.44％;小鼠血清对昆明小鼠单细胞胚体外发育无促进作用。可见,葡萄糖抑制昆明小鼠单细胞胚胎体外发育;在不含葡萄糖的条件下,EDTA支持小鼠早期胚胎体外发育;无论有无葡萄糖小鼠血清对小鼠早期胚体外发育无促进作用。     

GSH和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究活性氧(ROS)-过氧化氢和抗氧化剂-还原型谷胱甘肽(GSH)对小鼠2-细胞期胚胎体外发育的影响.用含有不同浓度H2O2的mSOF液培养小鼠胚胎,从H2O2浓度0.14 mg/L组开始的囊胚发育率显著低于对照组和其它组(P0.05);以mSOF液为基础液,在添加0.14 mg/L H2O2的基础上分别添加不同浓度的GSH,阳性对照组的囊胚发育率显著高于阴性对照组(P0.05);在添加外源性H2O2(0.14 mg/L)的情况下,随着GSH浓度的增加其囊胚发育率也显著增加.结果表明,H2O2可诱导小鼠2-细胞期胚胎体外发育的阻滞,GSH可阻止H2O2对小鼠2-细胞期胚胎的抑制效果.     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

家兔原核期受精卵的体外培养

原核期兔胚胎用微滴法分别在mDM液、TCM-199液和PBS液中进行培养,结果表明,发育到二细胞的百分率分别为96.95％(127/131),77.19％(44/57)和72.31％(47/65);发育到四细胞期的百分率分别为95.42％(125/131),64.91％(37/57)和63.08％(41/65);发育到八细胞期的百分率分别为84.73％(111/131),33.33％(19/57)和41.54％(27/65);发育到桑椹胚的百分率分别为67.94％(89/131),19.29(11/57)和23.08％(15/65)。以上结果说明:上述3种培养液中,改良DM液是把兔胚胎从原核期培养到桑椹胚的最佳培养液。     

小鼠胚胎电转外源物质条件的优化

旨在优化电转外源物质进入小鼠胚胎的条件,为电转CRISPR/Cas9系统进入小鼠胚胎进行基因编辑奠定基础。在不同的电转条件下分别将四甲基罗丹明标记的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)、带绿色荧光蛋白标记的质粒pLL3.7和体外转录的绿色荧光蛋白mRNA导入小鼠胚胎细胞,并进行培养,在荧光显微镜下观察胚胎发育状态,分析荧光染料进入胚胎及绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,高电压使胚胎成活率显著下降,低电压使电转效率显著下降。最适电压是110V,且小鼠胚胎2细胞期较1细胞期更适合电转。     

小鼠胚胎体外培养的研究——从囊胚期培养发育到体节期

在小鼠胚胎体外培养研究中,为筛选出适合囊胚期胚胎发育的最佳培养液,本研究分三个试验组进行。第一试验组的培养液主要由CMRL-1066和人脐带血清（HCS）组成;第二试验组的培养液是CMRL-1066加上胎牛血清（FCS）;第三试验组用TCM-199添加少量碳酸氢钠做培养液。在适宜的体外培养条件下,不同培养液获得了不同的培养成绩。试验结果表明：具有HCS的CMRL-1066培养液是把小鼠从囊胚期胚胎在体外条件下培养至体节期的最佳培养液;添加FCS的CMRL-1066培养液不够理想;而加进少量碳酸氢钠的TCM-199培养液则完全不适合培养囊胚期小鼠胚胎。     

速冻中低温保护剂浓度对小鼠胚胎发育的影响

用快速冷冻方法，冷冻小鼠的２－细胞胚、４－细胞胚、８－细胞胚、桑椹胚和囊胚，低温保护液分别含有０．５，１．５，２．５，４ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，含１０％的犊牛血清和０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，对于８－细胞以前的小鼠胚胎，快速冷冻保存时丙二醇的浓度在２．５ｍｏｌ／Ｌ和４ｍｏｌ／Ｌ时效果较好，随着小鼠早期胚胎（囊胚以前）的发育，抗低温冷冻的能力加强。     

Factors Affecting the Efficiency of Embryonic Cell Nuclear Transfer in Rabbits

Factors affecting the efficiency of nuclear transfer （NT） in rabbits were examined in the present study. When 100 V mm of pulse strength and 15 us of pulse duration were employed, 3 and 4 electronic pulses resulted in significantly more cytoplasts fused with donor cells compared with 2 electronic pulses （P〈 0.05）, but no significant difference was found in the cleavage rate of reconstructed embryos among the three groups （P〉0.05）. When the duration and number of electronic pulse were fixed at 15 ps and 3 times, increase of pulse intensity from 100 V mm 1 to 150 V mm^-1 and 200 V mm^-1 resulted in a significantly decrease in the cleavage rate of reconstructed embryos （P〈 0.05）, although the fusion rate did not significantly differ among the three groups （P〉 0.05）. Significantly more reconstructed embryos cleaved and developed to blastocysts when they were derived from donor embryos at the 8-16-cell stage, in comparison with the reconstructed embryos derived from donor embryos at the compact morula stage （P 〈 0.05）, although the fusion rate was similar （P 〉 0.05）. Activation of cytoplasts prior to fusion increased the cleavage rate （P〈 0.05） and blastocyst development （P〈 0.05） of reconstructed embryos, but decreased the fusion rate （P 〈 0.05） compared with cytoplasts activated post fusion. More reconstructed embryos developed to blastocysts when they were cultured in TCM ＋ 3% OCS at the first 48 h and then cultured in TCM199＋ 10% FCS, in comparison with the reconstructed embryos cultured in either TCM199＋ 10% FCS or TCM199＋3% OCS （P 〈 0.05）. When 22 NT embryos were transferred into the oviducts of one recipient rabbit, one recipient rabbit delivered a female rabbit at 34 days of gestation. In conclusion, either electrofusion parameter or developmental stage of donor embryos have a significant effect on the efficiency of NT, NT embryos require different concentration of serum at their different development stages.