牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中 ,以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层 ,观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为。结果表明 ,牛囊胚一般培养 36～ 6 0 h后孵化脱带 ,96～ 12 0 h后贴壁 ,12 0～ 144 h为ICM传代的最佳时刻。小鼠囊胚一般培养 12～ 2 4h孵化脱带 ,2 4～ 48h贴壁 ,72～ 96 h为传代的最佳时刻。牛胚胎贴附于饲养层上生长 ,极易从饲养层上剥离 ;小鼠胚胎镶嵌在饲养层中 ,滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密。牛ICM色深发黑 ,集落隆起程度较低 ;小鼠 ICM呈暗黄色 ,有呈柱状增殖的趋势。牛滋养层呈网状 ,小鼠滋养层为较致密的单层薄膜     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲层，观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为，结果表明，牛囊胚一般培养36－60h后孵化脱带，96－120h后贴壁，120－144h为ICM传代的最佳时刻，小鼠囊胚 般培养12－24h孵化脱带，24－48h贴壁，72－96h为传的最佳时刻牛胚胎贴附于饲养层上生长，极易从饲养层上剥离，小鼠胚胎镶嵌在饲养层中，滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密，牛ICM色深发黑，集落隆起程度较低，小鼠ICM呈暗黄色，有呈柱状增殖的趋势，牛滋养层呈网状，小鼠滋养层为较致密的单层薄膜。     

不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响

在TYH受精液中添加促卵泡素（FSH）和苯甲酸雌二醇（E2），检测不同浓度的FSH和E2对昆明小鼠的体外受精率的影响；检测在M16、CZB两种培养液中添加胎牛血清（FCS）与否对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响．结果表明：在．rYH中添加1．0IU／mL FSH，受精率和2-细胞胚率显著高于对照组；在TYH中添加0．1μg／mL E2，受精率和2-细胞胚率也显著高于对照组．在CZB中添加体积分数为10％FCS，可显著减少2一细胞期体外发育阻断，并显著提高小鼠胚胎体外发育的囊胚率，可见，以TYH添加1．0IU／mL FSH和0．1μg／mL E2为受精液，以含体积分数为10％FCS的CZB为胚胎培养液，小鼠胚胎可获得较高的囊胚率．葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的．     

干细胞因子对小鼠附植前胚胎体外发育的影响

为优化胚胎体外培养体系,提高胚胎体外培养发育率和发育质量,以昆明小鼠体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚为研究对象,研究不同浓度干细胞因子对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响。结果表明:在KSOM培养液中,小鼠自然受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚的卵裂率和桑椹胚率均无显著差异(P0.05),但IVN胚和IVF胚的囊胚发育率及囊胚细胞总数显著高于孤雌激活胚;培养液中添加不同浓度的干细胞因子对小鼠自然受精胚和孤雌激活胚的卵裂率、桑椹胚率、囊胚发育率和囊胚细胞总数都没有显著的影响(P0.05),但干细胞因子浓度为100ng·mL-1时,小鼠体外受精胚的桑椹胚率和囊胚发育率显著高于对照(P0.05)。     

牛和小鼠早期胚胎发育过程中细胞谱系发育调控的比较

高产奶牛繁殖效率低是世界性难题，其中早期胚胎死亡率高是主要原因之一。当前对牛早期胚胎发育的研究有限，而对于小鼠这种模式动物的早期胚胎发育研究已相当深入。因此，本文从胚胎形态、转录因子以及信号通路3方面对牛和小鼠早期胚胎发育过程进行比较，以加深对牛早期胚胎发育的认识。经比较发现，受精后，牛和小鼠早期胚胎在不同时期发生母源因子降解、合子基因组激活、细胞极性建立和不对称分裂，最终使得胚胎形态发生变化，形成具有3个胚层（滋养外胚层、上胚层和原始内胚层）的囊胚。此外，牛和小鼠早期胚胎发育过程中，多个转录因子及信号通路形成复杂网络调控细胞谱系分化。综上所述，在牛和小鼠早期胚胎发育过程中，相似的生物学事件陆续发生，但是细胞谱系分化的调控呈现差异性，提示我们将小鼠早期胚胎作为研究模型的局限性，该领域的研究对提高奶牛繁殖效率以及促进牛遗传改良工作具有重要意义。     

程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率.     

对昆明白杂种鼠胚胎体外培养的实验研究──2细胞期至卵圆筒期

利用ＣＭＲＬ—１０６６和国产其它药品对昆明白杂种小鼠２—细胞期的胚胎，进行了体外培养试脸，成功地将２—细胞胚胎在体外培养条体下，使之生长发育到卵圆筒阶段。从２—细胞期开始计算，囊胚形成率为７０％，卵化率为３０％，附植率为２％，卵圆筒期胚胎形成率为１％。试验发现，把２—细胞期小鼠胚胎体外培养到卵圆筒期比体外发育到同阶段推迟１～２天，此卵圆筒期胚胎的形成率与国外报道的２４％相比仍然很低，其原因估计可能为：１）小鼠的品种；２）国产药物的纯度；３）ＣＯ２条件不同而造成。     

猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

共培养体系中滋养层细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响

利用活体取卵(OPU)所得的卵母细胞与牛耳成纤维细胞构建牛体细胞核移植重构胚,并将所得的重构胚进行ACM(培养液)与不同滋养层细胞的共培养,分析不同滋养层细胞类型、传代次数、冻融处理对核移植胚胎体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养中滋养层细胞的合适条件。结果表明:胎鼠成纤维细胞(MEF)培养组的囊胚率和胚胎细胞数(38.2%和135±2.1)显著高于牛颗粒细胞(GC)组(9.1%和101±4.6,P<0.05)和牛耳成纤维细胞(BAF)组(25.9%和115±3.1,P<0.05)。2～4代MEF细胞与胚胎共培养的效果(38.2%和135±2.1)明显好于原代MEF细胞(24.7%和108±3.1,P<0.05)或5～8代MEF细胞(22.8%和102±2.8,P<0.05),新鲜的MEF细胞比冻融处理后的MEF细胞培养效果好(38.2%vs.27.7%,135±2.1vs.110±1.7,P<0.05)。因此,用新鲜的2～4代MEF细胞作为共培养体系中的滋养层细胞有利于牛核移植胚胎的早期发育。     

小鼠胚胎切割取样后体外培养发育能力的研究

本文对小鼠胚胎切割取样细胞数量的多少，取样后胚胎在室温中停留时间以及透明带存留与否的体外发育情况进行了研究，目的在于为牛胚胎性别鉴定切割取样时供借鉴和探讨。实验中的胚胎依据切割取样的细胞数分１０个细胞以内和大于１０个细胞以上两个组。其体外培养发育率分别为９５．７％（６７／７０）和７６．２％（３２／４２），两者差异极显著（Ｐ＜０．０１）；其中晚期桑椹胚、早期羹胚、扩展囊胚的体外发育率分别为８７．７％（６４／７３）、８６．２％（２５／２９）、１００％（１０／１０），三者之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；培养前在室温下停留３～７ｈ和９ｈ的体外培养发育率分别为９４．８％（７３／７７）、５７．１％（２０／３５），两者差异极显著（Ｐ＜０．０１）；胚胎取样后透明带存留和脱失的体外培养发育率分别为８７．９％（５１／５８）和８３．３％（４５／５４），两者差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

Research on Growth Behavior of Embryos for Bovine and Murine on Primary Murine Embryos Fibroblast Cell Feeder Layer

The difference in growth behavior between bovine embryos and murine embryos was studied on PMEF(primary murine embryos fibroblast)feeder layer. The results showed as follows: With embryos having attached, bovine embryonic trophoblast formed a transparent membranous structure covering on inner cell mass (ICM), however, murine embryonic trophoblast formed disc structure. Bovine embryos formed four kinds of ICM colonies with different morphology including the mass-like, the net-like, the stream-like and the mixture-like colonies. Compared with Murine ICM, the bovine ICM grew more fast. So, the bovine ICM was passaged at first after a culture of approximately 5 - 6 days in vitro, but murine ICM was passaged at first after an attachment of 3 - 4 days on PMEF feeder layer. The mixture colonies of bovine ICM differentiated very early, while the others differentiated very late. Most ICM-like mass of Bovine grew in a defined spot, but bovine ICMs like stream and ICMs like net proliferated fast and dispersed quickly. We found that the single blastomeres derived from late bovine morula and late murine morula formed sub-blastophere; moreover, the bovine ICM cell would differentiate rapidly if the trophoblast was removed.     

Research on Isolation and Clone of Embryonic Stem Cell-Like in Bovine

Bovine embryonic stem cell would be invaluable for researching the aspect of animal cloning, production transgenic animal and discussion of gene function in vitro. With the object of establishing an effective culture system for isolation and clone of bovine pluripotent stem cell, we cultured bovine embryos and mouse embryos including morula blastula and hatached blastula and obtained animal ICM on Primary marine embryonic fibroblast (Primary murine embryonic fibroblast, PMEF) feeder layer with tissue medium(DMEM supplemented with 15ml/100ml NBS ,0.1μmol/L Na2SeO3, 0. 1mmol/L β-mercaptoethanol, 1 000ng/ml LIF,10 ng/ml IGF, 1mmol/L necessary amino acid and 1mmol/L L-glutamine), then, we obtained mouse ICM and bovine ICM. Moreover, we isolated and cloned the 6 passage bovine ES like cells(12 cell lines) and 9 passage marine ES like cells (52 cell lines) deriving from bovine ICM and murine ICM respectively on the feeder layer of PMEF by disaggregating ICM and ES cell clones of bovine and murine into smaller clumps through digesting with 0. 125g/100ml trypsin and 0.02g/100ml EDTA and scattering with a glass needle. The pluripotency of both murine and bovine ES like cells was identified with morphological character, histochemistry identification, karyotype analysis and differentiation of ES cells in vitro or in vivo. This result showed that bovine embryonic stem cell and murine embryonic stem cell had developmental pluripotency.     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

兔类胚胎干细胞的体外培养

为了确立兔类胚胎干细胞(ESCs-like)体外培养方法,研究探讨了兔囊胚形成环境与饲养层细胞对内细胞团(ICM)增殖、ICM原代集落形成以及集落碱性磷酸酶(AKP)阳性率的影响,并在MEF和REF饲养层上进行了兔ESCs-like的体外培养。结果显示,去除透明带桑葚胚在体外具有较高的囊胚发育率和囊胚贴壁率(P<0.05),体外发育囊胚ICM原代集落的AKP阳性率却显著低于体内发育囊胚(P<0.05);与MEF饲养层相比,REF饲养层上ICM原代集落的形成率显著偏低(P>0.05),但原代集落的AKP阳性率却显著高于其余各组(P<0.05);MEF饲养层与REF饲养层均支持兔ESCs-like的传代培养,但F3代后MEF组中ESCs-like的集落形成率显著高于REF组(P<0.05)。     

机械分割的小鼠桑椹胚和囊胚的发育能力

利用机械方法二等份分割小鼠的桑椹胚、早期囊胚和晚期囊胚,并在体外培养分割的半胚到晚期囊胚。将这些囊胚移植到假孕受体鼠子宫内以评价他们附植后发育的能力。在体外培养中发现,囊胚期分割的胚胎比桑椹胚期分割的胚胎有较高的成活率。通过附植前胚胎细胞数量分析得知,囊胚期半胚的细胞数量大约是对照组的一半,但内细胞团细胞与整个胚胎细胞的数量比不变。虽然从半胚发育到囊胚期的胚胎附植率仅略低于对照组,但半胚形成胎儿的能力却显著低于全胚。组织学分析表明,附植后的这种低成活率现象是由于缺乏卵柱发育造成的,而此卵柱则与半胚中的内细胞团的细胞数量减少有关。移植到第3天假孕受体鼠中的半胚,附植后的发育情况明显地比移植到第4天受体中的好。     

谷胱甘肽（GSH）对牛卵母细胞体外受精胚胎发育的影响

［目的］研究谷胱甘肽（GSH）对牛体外受精胚胎发育的影响。［方法］通过对牛卵母细胞进行体外受精和受精卵体外培养，研究了谷胱甘肽（GSH）对牛胚胎体外发育的影响。［结果］添加谷胱甘肽组的桑囊率分别比对照组高3.34%和2.26%，囊胚发育率分别比对照组高4.57%和4.05%，但差异不显著（P〉0.05）。［结论］GSH在牛体外受精的胚胎发育过程中有一定的保护和促进作用。     

Culture of Small Barley Embryos on Defined Media

Barley embryos, measuring 90 Fz in length, grew and became differentiated on a phosphate-enriched White's medium which was fortified with glutamine and alanine as major sources of organic nitrogen, and lesser amounts of five other amino acids. The pH of the medium was a critical factor in differentiation. On this medium, excised barley embryos developed more rapidly than embryos remaining in vivo, or embryos grown on media containing coconut milk.