胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质，以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植，观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组，组1：排卵后5-6d（不含6d）；组2：排卵后6—7d；组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言，第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05），第3组的受孕率最低（Pt0．05），且120d的受孕率为0。与此相反，对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植，可得到较高的妊娠率。     

转基因小鼠后代乳汁中外源基因的表达

运用传统育种方法，用整合有人凝血因子Ⅸ(hFⅨ）的转基因小鼠交和远交。通过选育，在其后代中出现4只双重杂合子（3♀，1♂）及2只纯合子小鼠（2♀）。收集雌鼠乳汁，用ELISA测定其中hFⅨ蛋白含量。结果表明，相对于单纯杂合子小鼠，纯合子小鼠的表达量无增高（P＞0．05），而双重杂合子小鼠的表达量有显著提高（P＜0．01）。结果提示 ，选育双重杂合子转基因后代小鼠，是一条提高转基因动物外源基因表达水平的有效途径。     

不同亚种牛卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析

在体细胞核移植(克隆)试验中,作为受体细胞的卵母细胞是制约克隆效率的重要因素之一.本文通过对鲁西黄牛和荷斯坦奶牛进行活体取卵(OPU)试验,并以两个不同亚种的卵母细胞分别作为受体细胞进行奶牛体细胞克隆和胚胎移植试验,经卵母细胞克隆效率和胚胎移植效果分析,探讨以鲁西黄牛代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体的可行性.结果显示,夏季鲁西黄牛OPU的效果更好,用鲁西黄牛卵母细胞构建的重构胚的融合率显著高于荷斯坦奶牛;鲁西黄牛卵母细胞形成的克隆胚移植后,其妊娠率、产犊率和活产率与荷斯坦奶牛相当;采用不同亚种克隆胚和不同类型受体牛互相组合进行胚胎移植,结果表明亚种内移植组妊娠率明显高于亚种间移植组,而且亚种内移植组非妊娠牛的返情时间也明显推后.以上结果说明,鲁西黄牛可以代替荷斯坦奶牛作为卵母细胞的供体和胚胎移植受体牛;不同亚种受体牛与克隆胚的适当组合可以显著提高胚胎移植的效果.本研究为以后开展不同亚种间克隆提供了可行性参考.     

人血清白蛋白基因乳腺表达载体在奶山羊乳腺中的瞬间表达

构建了包括人血清白蛋白 ( h ALB)基因的 c DNA全序列、内含子 1以及山羊β-酪蛋白基因启动子和 5′端上游调控序列在内的乳腺表达载体 pc DNA3.1 -GCALBm,采用直接注射法将其导入哺乳期的奶山羊乳腺组织 ,然后通过放射免疫法测定乳汁中 h ALB的含量。结果显示 ,5头受试奶山羊的乳汁中有明显的 h ALB表达 ,注射后第 2天放免测定值从注射前的 4 .0 mg/L左右分别上升至 62 .2、59.2、36.2、4 2 .3、1 7.5mg/L,并持续表达在 2周以上 ,其中 1头受试羊乳汁中 h ALB的表达量维持在 80 mg/L左右 ,并超过了 1 0 0 d。而在乳腺组织中注射 pc DNA3.1空质粒或生理盐水的 4头对照奶山羊的乳汁中 ,放免测定值无变化。     

三种培养基对牛体外受精胚胎发育的影响

本文比较了三种培养基：（1）B2（LABORNI、OIREC．C．D,France）＋颗粒细胞（GC）、（2）IVMD-101（FHK,Japan）、（3）ACM（本实验室自配）＋胎鼠成纤维细胞（MEF）,对牛体外受精胚胎发育的影响。结果显示,以卵裂率（％）来说,第1,2组和第3组分别为65．3±0．05、73．8±0．12及72．7±0．12;以囊胚率（％）来说,第1,2组和第3组分别为33．8±0．05、10．5±0．07及38．9±0．18;而以AB级囊胚率（％）来说,第1,2组和第3组分别为67．6±0．05、60．1±0．04及71．8±0．11。因此,通过统计分析,在我们所研究的三种培养基中,ACM＋MEF效果最好。     

共培养体系中滋养层细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响

利用活体取卵(OPU)所得的卵母细胞与牛耳成纤维细胞构建牛体细胞核移植重构胚,并将所得的重构胚进行ACM(培养液)与不同滋养层细胞的共培养,分析不同滋养层细胞类型、传代次数、冻融处理对核移植胚胎体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养中滋养层细胞的合适条件。结果表明:胎鼠成纤维细胞(MEF)培养组的囊胚率和胚胎细胞数(38.2%和135±2.1)显著高于牛颗粒细胞(GC)组(9.1%和101±4.6,P<0.05)和牛耳成纤维细胞(BAF)组(25.9%和115±3.1,P<0.05)。2～4代MEF细胞与胚胎共培养的效果(38.2%和135±2.1)明显好于原代MEF细胞(24.7%和108±3.1,P<0.05)或5～8代MEF细胞(22.8%和102±2.8,P<0.05),新鲜的MEF细胞比冻融处理后的MEF细胞培养效果好(38.2%vs.27.7%,135±2.1vs.110±1.7,P<0.05)。因此,用新鲜的2～4代MEF细胞作为共培养体系中的滋养层细胞有利于牛核移植胚胎的早期发育。     

体细胞核移植克隆牛的遗传物质鉴定

应用活体取卵(OPU)技术采集遗传背景清晰的卵母细胞作为受体细胞,与不同来源的供体细胞核进行体细胞核移植(SCNT)。通过微卫星DNA及线粒体DNA检测,分别对5头克隆牛核内和核外DNA进行了分析。结果表明克隆牛的微卫星DNA与核供体牛完全一致,而线粒体DNA则全部来源于卵母细胞。     

青年奶牛活体取卵技术的研究

本文利用B超活体取卵技术(ovumpickup,OPU)对青年荷斯坦奶牛活体取卵,探讨影响活体取卵的因素及对青年奶牛发情周期的影响。4头青年荷斯坦奶牛在连续观察两个发情周期后,进行连续的一周一次OPU操作,持续16周,然后观察OPU后的发情周期特征及卵巢状况。结果显示:在数量上,个体间穿刺卵泡的总数和回收卵母细胞的总数不完全一致,但卵泡直径的百分比构成个体之间无显著差异(P>0.05),回收率相似;在质量上,各级卵母细胞的构成在各个体间没有显著差异(P>0.05);OPU期间奶牛出现情期延长的趋势,且发情表现减弱,但停止OPU后发情基本正常。研究表明:利用活体取卵技术对青年荷斯坦奶牛进行每周一次的长期连续取卵,在一定的条件下,能够达到较为稳定的回收率和获得一定数量和质量的卵母细胞,但会导致奶牛发情周期的改变,而在停止OPU后能较快恢复。     

应用氯前列烯醇诱导山羊多胎率的研究

为了增加养羊业的经济效益,以及医学、药学进行山羊动物试验的需要,必须提高山羊的繁殖效率,增加山羊怀孕的多胎率。为此作者特设计采用氯前列烯醇(Cloprostenol)对华东地区的山羊(江苏海门山羊)进行同步处理并配种以达到提高山羊的多胎率,提高山羊利用效率的目的。试验分成两组,氯前列烯醇诱导组(T)136头和非诱导组(UT)136头。结果显示,采用氯前列烯醇诱导的山羊(T)多胎率达到78.7%(107/136),怀孕羔羊数平均达到了2.01只/胎(273/136),而未采用氯前列烯醇诱导的对照组山羊(UT)的多胎率只有39.0%(53/136),怀孕胎数平均为1.31只/胎(179/136),两组之间差异极显著(P<0.01),氯前列烯醇处理组羔羊出生后生长、发育正常。本试验结果表明,通过氯前列烯醇诱导可以明显提高山羊的怀孕多胎率,对山羊优良品种的繁育、种群的快速扩繁及试验用山羊的研制等具有重要的经济价值和应用价值。     

影响牛活体取卵(OPU)的因素

在B超扫描监视下进行牛的活体取卵（OPU）,根据获得卵母细胞的数量、质量和试验牛的繁殖力对OPU的效果进行评估,并分析影响OPU效率的因素。结果表明,OPU的效率受季节、品种（鲁西黄牛和荷斯坦奶牛）、个体差异和吸卵压力的影响。但是重复每周进行1次OPU操作,对获得卵母细胞的数量、质量和试验牛的繁殖力并无影响。因此,OPU技术可为体外生殖的研究和高质量胚胎的生产提供充足而理想的卵母细胞的一种有效途径。