猪传染性胃肠炎病毒福建株的分离鉴定

采集福建省某猪场爆发的疑似病毒性腹泻的病死仔猪病料,利用ST细胞从病死仔猪空肠及肠系膜淋巴结材料中分离获得1株病毒,对该病毒进行快速金标检测、电镜形态学观察、中和试验及RT-PCR鉴定后,证实该分离株为TGEV,命名为TGEV福建分离株(TGEV-FJ)。该分离毒在ST细胞上的毒价约为10-6.75.(100μL)-1。TGEV-FJ株N基因全长1 149bp,编码382个氨基酸,将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中TGEV参考毒株进行比较分析,两者核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。     

产蛋鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其遗传变异和血清型分析

[目的]明确产蛋鸡源传染性支气管炎病毒(IBV)分离株(GX-YL170808)的结构基因及抗原变异情况,为广西种鸡场的传染性支气管炎(IB)防控提供科学依据.[方法]通过鸡胚尿囊液血凝试验、鸡胚侏儒化试验及3'端非编码区(3'-UTR)测序对分离株进行鉴定;采用RT-PCR扩增S1、E、M和N基因,以MegAlign和MEGA 6.0分别进行核苷酸序列相似性及系统发育进化树分析,运用RDP4和SimPlot对S1、E、M和N基因进行重组分析,利用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0进行糖基化位点预测分析,并通过中和试验进行血清型鉴定.[结果]分离株的鸡胚尿囊液血凝试验呈阴性,鸡胚盲传5代后出现侏儒胚典型病变,其3'-UTR序列与IBV的3'-UTR序列相似性为99.13%;综合病鸡临床症状及其病理变化可确定该病毒为IBV,命名为GX-YL170808.GX-YL170808分离株S1、E、M和N基因的开放阅读框(ORF)长度分别为1620、327、675和1230 bp,对应编码540、109、225和410个氨基酸残基,与参考株的核苷酸序列相似性分别为60.4%~96.5%、81.8%~97.2%、85.6%~93.5%和85.7%~92.0%;GX-YL170808分离株的S1、M和N基因属于LX4型,而E基因属于LDT3型;4个结构基因内部均无重组区域;除S1基因同时具有N-糖基化和O-糖基化位点外,E、M和N基因均只有N-糖基化位点;S1蛋白裂解位点为HRRRR,与参考株LX4的裂解位点相同.GX-YL170808分离株属于血清4型,不同于常用的疫苗株H120(血清3型)和4/91(血清5型),也不同于广西主要侵害雏鸡的IBV优势血清型.[结论]产蛋鸡源IBV分离株并非疫苗株,其基因型和血清型均已发生变异,且该毒株的血清型不同于广西地区侵害雏鸡的优势血清型,提示了广西地区IB防控的严峻性及新型多价疫苗研发的紧迫性.     

草鱼MyoD基因SNP和Indel标记的筛选及其与生长性状的关联分析

为探索MyoD基因多态性对草鱼(Ctenopharyngodon idella)生长性状的影响,采用PCR产物直接测序的方法,检测草鱼MyoD基因上的突变位点,并分析其与草鱼生长性状的相关性。结果表明:在草鱼MyoD基因上筛选到4个多态性高、分型稳定的突变位点,即M1(940后T碱基的插入)、M3(1630后重复单元AATAGCCT的缺失)、M4(G1669A)和M5(A1681T)。M1位点不同基因型个体间的体长、全长、尾柄长和尾柄高存在显著差异(P0.05),纯合缺失基因型(DD)显著大于纯合插入基因型(TT);M3和M4位点不同基因型个体间的生长性状差异均不显著(P0.05);M5位点不同基因型个体间的体质量、体宽、体高和眼间距存在显著差异(P0.05),优势基因型为TT。MyoD基因的M1和M5突变位点可作为草鱼选育的候选分子标记。     

鹅副粘病毒M基因主要抗原位点片段的原核表达及鉴定

根据GenBank中发表的GPMV SF02株M基因核苷酸序列设计合成一对引物,通过RT-PCR扩增JS/1/97/G0株M基因主要抗原位点片段M1,将其克隆入pMD18-T载体,序列测定和分析表明,所扩增的M1基因核苷酸长为444 bp,共编码148个氨基酸.将M1同载体PGEX-6P-1连接后,转化入E.coli BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达出目标蛋白,与预计相符.对表达的M1蛋白进行Western blot鉴定,表明所表达的M1蛋白可以与GPMV SF02株阳性血清发生特异性反应.     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株非编码区及结构蛋白的生物信息学分析

利用生物软件对猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株非编码区及结构蛋白所含的生物学信息进行了分析。结果显示,SC-Y株与TGEV其他参考毒株(Miller M60、Miller M6、Purdue、Purdue P115、PUR46-MAD、TS)5′UTR的二级结构差异显著,预测结构蛋白特性显示,N蛋白没有跨膜区域、糖基化位点及信号肽序列,属于非分泌性蛋白。在4种结构蛋白中,N蛋白的氨基酸变异率最低,为2.14‰。与MillerM60株、Miller M6株和TS株相比,SC-Y株S基因第1 123~1 128位核苷酸缺失6个碱基(AATGAT),在sM基因核苷酸第163~165位,SC-Y株比TFI株和FS772/70株多出3个碱基(ATT)。     

两株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。     

传染性胃肠炎病毒陕西分离株S基因主要抗原位点基因的克隆与序列分析

根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR从用细胞增殖的TGEV病毒液中扩增编码S基因B、C抗原位点的基因片段,然后将获得的片段克隆至pMD18-T载体上,构建重组质粒。通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒,将测序结果与GenBank公布的21个相关序列进行多序列比较并绘制进化树。所克隆的TGEV陕西分离株S基因B、C抗原位点基因片段长度为765 bp,与参考毒株的核苷酸同源性为96.1%~99.9%。进化树分析表明,分离株与中国的H株、HN2002株、TS株,美国的Miller M60株、Miller M6株及英国的FS772株亲缘关系较近,与H株的亲缘关系最近。     

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。     

2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析

[目的]明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性(抗原性、耐药性和致病性),为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据.[方法]以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段(HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因),经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析.[结果]2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框(ORF)分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410 bp、M:982 bp和NS:838 bp.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点(NCS);NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63~65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234 aa处非常保守,但发生W402S突变.[结论]从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性.因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播.     

NDV F与ChIL-18融合基因"自杀性"质粒的构建

根据GeneBank公布的鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株F基因和鸡源性白细胞介素18(ChIL-18)基因序列分别设计特异性引物,且在鸡NDV F基因引物上游引入BamH Ⅰ位点、下游引入Sal Ⅰ位点,在Ch IL-18基因引物上游引入Sal Ⅰ位点、下游引入Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位点.以鸡新城疫病毒Lasota株RNA为模板RT-PCR扩增其F基因,将F基因插入pMD18-T的BamH Ⅰ与Sal Ⅰ位点中.同时扩增上游带有Sal Ⅰ位点、下游带有Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位点的ChIL-18基因,并将其插入到含有F基因的pMD18-T质粒的Sal Ⅰ、Hind Ⅲ位点之间,从而使NDV F基因与ChIL-18基因形成具有一个完整阅读框的融合基因,然后将融合基因片段定向克隆到pSFV单一启动子(CMV)下游,构建成F-ChIL-18融合基因重组"自杀性"质粒pSFV-F-ChIL-18.     

PmC47-8株OmpH蛋白结构的初步预测(英文)

[目的]对牦牛源多杀性巴氏杆菌C47-8株(PmC47-8)OmpH蛋白结构进行初步预测。[方法]对PmC47-8型菌株OmpH基因的测序结果进行在线BLAST比对、信号肽预测、二级结构预测及蛋白特性等方面的分析。[结果]PmC47-8株OmpH基因与已公布的81条OmpH基因相似性在84%～99%间;OmpH蛋白序列中存在信号肽,切割位点在第20号和21号氨基酸残基之间;OmpH蛋白二级结构预测中,折叠结构占49.8%,环状结构占50.2%;推测OmpH蛋白有7个O型糖基化位点,分别是位于第2、45、48、330、716、721、723号位的氨基酸残基,2个N型糖基化位点,即第15和35号位的氨基酸残基。[结论]该研究为牦牛源OmpH基因的免疫研究奠定基础。     

PMC47-8株OmpH蛋白结构的初步预测

[目的]初步预测牦牛源多杀性巴氏杆菌C47-8株(PmC47-8)OmpH蛋白结构特点。[方法]对PmC47-8型菌株OmpH基因的测序结果进行在线BLAST比对、信号肽预测、二级结构预测及蛋白特性等方面的分析。[结果]PmC47-8株OmpH基因与已公布的81条OmpH基因相似性在84%～99%间;OmpH蛋白序列中存在信号肽,切割位点在第20号和21号氨基酸残基之间;OmpH蛋白二级结构预测中,折叠结构占49.8%,环状结构占50.2%;推测OmpH蛋白有7个O型糖基化位点,分别是位于第2、45、48、330、716、721、723号位的氨基酸残基,2个N型糖基化位点,即第15和35号位的氨基酸残基。[结论]该蛋白可能存在于细胞菌膜的外侧,而非跨膜蛋白。     

猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达

为了解猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)在中国的流行与遗传变异情况,对新分离的FIPV AH1905株的N基因进行了克隆和序列比对分析,并利用生物信息学软件对N基因编码蛋白的二级结构进行了预测。最后,将N基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,在原核细胞中进行表达,并制备鼠源多克隆抗体。测序结果表明,FIPV AH1905株的N基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸。序列比对分析结果显示,FIPV AH1905株与报道的FIPV参考毒株的核苷酸同源性为90.2%~92.4%,氨基酸同源性为91.8%~93.9%,与国内其他分离株位于同一进化分支,同属于FIPV基因Ⅰ型。对N蛋白二级结构预测结果显示,该蛋白具有高度亲水性,其二级结构主要由α螺旋(h)(14.06%)、延伸链(e)(15.12%)、β转角(t)(3.71%)和无规则卷曲(c)(67.11%)组成,无信号肽区域和跨膜结构域,存在48个潜在的磷酸化位点,含有6个潜在的B细胞抗原表位、2个CTL表位和2个Th表位。Western blot检测结果证明,N蛋白在大肠埃希菌细胞中主要以包涵体形式大量表达,相对分子质量约为68 ku,具有良好的反应原性。以上结果可为进一步开展FIPV的流行病学和分子生物学研究奠定基础。     

羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析

试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。     

柴达木盆地梭梭CMO基因的克隆及其蛋白结构预测

对柴达木盆地梭梭的CMO基因进行扩增,并利用生物软件对CMO基因序列进行分析、对蛋白结构进行预测。结果表明,柴达木盆地梭梭CMO基因长度为1 341 bp,编码447个氨基酸。CMO蛋白亲水性、二级结构、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋区、三级结构预测结果显示柴达木盆地梭梭CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体,无信号肽,蛋白二级结构主要为无规则卷曲。CMO蛋白具有多个多种类型的功能位点,为蛋白功能的实现提供了保障。此外CMO蛋白的亲水性较强,无跨膜螺旋区。柴达木盆地梭梭CMO蛋白三维结构预测结果显示CMO蛋白三维结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲互相盘绕而成。     

植物咖啡碱合成酶的生物信息学分析

采用生物信息学分析方法对 GenBank 中来源于茶树、可可、山茶等植物咖啡碱合成酶的氨基酸序列进行比对分析,就等电点、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋、保守性功能结构域及基序、二级结构与三级结构等重要参数进行预测与分析。结果表明,植物咖啡碱合成酶主要定位于胞质和胞核中,含有磷酸化、酰基化和糖基化修饰位点,基于基因序列与保守结构域可被分成3种类型,其中 I 型与 II 型酶蛋白均属全α型水溶性酶蛋白,III 型酶蛋白除二级结构富含无规卷曲构件,还极有可能存在信号肽序列,但3类酶蛋白均无跨膜螺旋,三级结构预测显示,I 型、II 型酶蛋白极为相似,由α螺旋和横向β-折叠片层组成,III 型则α螺旋位于横向两端,中间由纵向β-折叠片层连接。     

斯氏副柔线虫SHR基因表达载体的构建及生物信息学分析

为探讨斯氏副柔线虫免疫相关SHR基因作为疫苗候选抗原及早期诊断抗原的可能性,提取斯氏副柔线虫的总RNA,用RT-PCR技术扩增SHR基因,并将PCR产物克隆到pMD19-T载体,构建原核表达载体pET-30a(+)-SHR,利用在线软件对该基因编码蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆获得SHR基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸,理论等电点为6.09,无信号肽和跨膜区;磷酸化预测含有29个磷酸化位点;结构分析发现,α-螺旋构成二级结构的主要成分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,SHR蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白。推测SHR有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。