猪德尔塔冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10¹~6.26×10⁸copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10¹copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。     

猪流感的防控及检测样品采集方法

1猪流感及其防控意义猪流感(swine influenza,SI)呈世界性分布,各地均有流行,发病率高[1]。猪流感能直接引起患病猪的死亡,并使患病猪的生长或生产不良,对养猪业的危害极大,研究表明康复猪和隐形感染猪是以后猪流感的传染源,猪流感作为一种主要的免疫抑制疾病,在猪场中普遍存在且难以根除[1,2]。猪在感染猪流感病毒(SIV)后,易导致呼吸系统疾病的并发或者混合感染,加剧流感病毒危害性,加大死亡率。猪也是流感病毒"混合器",极易产生流感病毒基因重排带来极其严重的公共卫生安全问题,因此猪流感的防控极其重要。     

2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析

[目的]明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性(抗原性、耐药性和致病性),为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据.[方法]以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段(HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因),经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析.[结果]2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框(ORF)分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410 bp、M:982 bp和NS:838 bp.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点(NCS);NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63~65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234 aa处非常保守,但发生W402S突变.[结论]从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性.因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播.     

2016—2018年广西玉林市和百色市主要家畜疫病定点监测

为了解广西地区口蹄疫(FMD)、猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪伪狂犬病(PR)、布鲁氏菌病和小反刍兽疫(PPR)等重大动物疫病的免疫动态、疫情流行风险,按照国家动物疫病定点监测实施方案相关要求,2016—2018年运用ELISA和实时荧光定量PCR方法,对玉林市和百色市20个定点监测场点的猪、牛、羊开展病原学监测和抗体监测。病原监测结果显示:2016—2018年,未在牛羊群中检出FMD、PPR病原;2016年和2017年CSF病原检出率均为0.38%;3年内均有PRRS病原检出,检出率介于1.89%~6.32%。抗体检测结果显示:2016—2018年,猪O型FMD、CSF、PRRS和PR-gB抗体阳性率均在70%以上,A型FMD抗体阳性率逐年上升,NSP抗体和PR-gE抗体阳性率呈波动状变化;牛O型FMD抗体阳性率分别为94.78%、18.26%、71.11%,亚洲I型分别为76.52%、25.22%、27.78%,NSP抗体阳性率在22.61%~41.74%之间波动;仅2016年检出1份牛布鲁氏菌抗体阳性;3年间,羊O型、亚洲I型FMD和PPR免疫抗体阳性率都很低,未达到70%,且呈下降趋势,NSP抗体阳性率在0.95%~7.62%之间波动,未检出羊布鲁氏菌抗体。结果表明,广西玉林市和百色市的猪群O型FMD、CSF、PRRS、PR免疫效果较好,但牛羊群FMD和PPR免疫效果较差,猪群中仍有CSF、PRRS、PR等疫病流行,牛羊群中存在FMD流行的风险,但牛羊布鲁氏菌病得到有效控制。结果提示,应继续加强上述疫病的免疫和监测,针对免疫效果较差、病原流行率偏高的疫病,要重点做好防控和净化。     

广西贵港地区猪繁殖与呼吸障碍综合征调查分析

【目的】了解广西贵港地区猪繁殖与呼吸障碍综合征的感染情况,为广西贵港地区猪繁殖与呼吸障碍综合征的监督及防控工作提供参考。【方法】通过对Nsp2基因的分析,合成新的特异性诊断引物,并利用RT-PCR的方法对广西贵港地区111个规模猪场采集的1865份扁桃体同时进行高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征和经典猪繁殖与呼吸障碍综合征的分子流行病学调查。【结果】25个猪场检出92份猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒,场点总阳性率为22. 5%,样品总阳性率为4. 93%。其中9个猪场检测出24份高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒,场点阳性率为8. 10%,样品阳性率为1. 29%; 18个猪场检测出68份经典猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒,场点阳性率为16. 2%,样品阳性率为3. 65%; 2个猪场同时检测出高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和经典猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。【结论】广西贵港地区规模猪场感染猪繁殖与呼吸障碍综合征的现象较为严重。